病毒TCID50测定方案

1TCID50测定方案20121123391简介TCID50(TissueCultureInfectiveDose)，半数组织培养感染量，又称50%组织细胞感染量，指能在半数细胞培养板孔或试管内引起细胞病变(Cytopathiceffect，CPE)的病毒量。将不同稀释度的病毒接种到96孔板上培养的单层细胞上。观察细胞病变，待细胞不再病变时记录每个稀释度出现病变和未出现病变的孔数，按照Reed-Muench公式计算TCID50值。2试剂试剂来源保存条件DMEM-basic培养基Gibco，上海4℃保存胰蛋白酶Gibco，-20℃冻存胎牛血清FetalbovineserumHyclone，-20℃冻存PBSHyclone，-20℃冻存3仪器与耗材仪器规格耗材规格CO2培养箱细胞培养瓶25cm2生物安全柜无菌离心管15mL，50mL倒置显微镜一次性移液管1mL，2mL，5mL，10mL显微照相系统细胞培养板96孔高速冷冻离心机电子天平移液器液氮罐电冰箱4细胞及培养基DF-1细胞株细胞生长液（500mL）：20%FBS（胎牛血清）+1%双抗（青链霉素）+剩余用DMEM100mL5mL395mL细胞维持液（50mL）：1%双抗（青链霉素）+DMEM（无血清）+1%FBS0.5mL49mL0.5mL细胞冻存液（50mL）：70%DMEM-basic+20%FBS+10%DMSO35mL10mL5mL4℃保存备用5病毒株及培养方法禽流感病毒（Avianinfluenzavirus，AIV），H5N1株；禽白血病病毒（Avianleukosisvirus，ALV），HPRS-103株；禽传染性支气管炎病毒（Infectiousbronchitisvirus，IBV），H52株；禽传染性法氏囊病病毒（Infectiousbursaldiseasevirus，IBDV），B87株。2病毒培养方法：DF-1细胞培养和鸡胚培养。6操作步骤6.1DF-1细胞的传代1.吸弃细胞培养瓶中旧的培养液；2.加入灭菌PBS5mL清洗细胞，重复两次；3.加入1ml0.25%的胰蛋白酶消化；4.约40s左右（置于显微镜下观察，发现细胞圆缩、胞间隙增大），站立放置细胞瓶，并加入细胞生长液10mL，反复吹打瓶壁细胞(吹打过程要轻柔且尽可能不出现泡沫)，并将细胞吹散，之后取两只新的细胞培养瓶，开盖待用；5.向原细胞瓶中再加入细胞生长液10mL，并吹吸混匀，然后吸取约7ml细胞悬液加入到2个新的培养瓶中；6.37℃5%CO2中培养3天，期间观察细胞生长情况，细胞长至占瓶壁70%-80%时可接种病毒，长满可传代。6.2DF-1细胞的冻存1.取生长48-72h的DF-1细胞，吸弃旧的培养液；2.吸取无菌PBS5mL清洗细胞，重复两次；3.加入1mL0.25%胰蛋白酶消化；4.约40s左右后，加入3mLDF-1细胞生长液终止消化，并吹打细胞瓶壁，使细胞悬浮于生长液中；5.吹吸细胞，使混匀，之后将细胞悬液转移至50mL无菌离心管中；6.1000rpm，室温离心10min；7.弃上清，加入细胞冻存液，置-20℃、-80℃梯度冻存，最后保存于液氮中。6.3TCID50的测定6.3.196孔板培养细胞1.取1瓶长满的细胞，吸弃培养瓶中旧的培养液；2.吸取无菌PBS5mL清洗细胞，重复两次；3.向瓶内加入1ml胰蛋白酶消化；4.约40s左右后（置于显微镜下观察，发现细胞圆缩、胞间隙增大），站立放置细胞瓶，并加入细胞生长液10mL，反复吹打瓶壁细胞(吹打过程要轻柔且尽可能不出现泡沫)，并将细胞吹散；5.吸取一滴细胞悬液置于细胞计数板上，对细胞进行计数；6.加入细胞生长液稀释细胞悬液至含细胞22.2万个/mL（约4万个/孔）；7.取一块96孔板，每孔加100μl的细胞悬液（枪头紧贴孔的一侧壁且不接触孔底，缓缓将细胞打下去，每加8孔，将未加的细胞悬液均匀混合），铺好后静置5min观察细胞，再放入37℃培养箱中培养至细胞长到70%-80%。6.3.296孔板接种病毒1.将病毒室温解冻。吸取细胞维持液9mL，再吸取1ml病毒液，用0.22μm微孔滤膜过滤至15ml无菌离心管中，记为1号管；2.另取10只1.5ml无菌离心管，编号2-11，将1中病毒悬液用细胞维持液10倍递次稀释成10-2至10-11不同的稀释度；33.弃去96孔板中的旧培养液（甩板法：紫外灭菌前将铺有纱布的托盘置于工作台灭菌），分别在每孔加入100μl的无菌PBS洗涤，重复两次；4.每孔接种100μl上述梯度稀释的病毒液，每个稀释度接种8孔。并设置1列正常细胞对照组，每孔加100μl细胞维持液，37℃CO2培养箱中吸附1h。（图1）图196孔板中病毒接种1：细胞对照组；2-12：为接种病毒组5.1h后每孔加入细胞维持液100μl，放入37℃培养箱中继续培养。6.每日在倒置显微镜下观察细胞病变（70%以上的细胞出现CPE判为感染），记录病变程度和孔数（并拍照），待细胞病变不再继续（约72h后）后判定并记录结果（表1）。表1病毒液稀释度出现CPE孔数无CPE孔数累计出现CPE孔所占的%CPE孔数无CPE孔数10-110-210-310-410-510-610-710-810-910-107.按照Reed-Muench计算法计算（本实验用100TCID50/0.1ml）：距离比例＝（高于50%病变率的百分数-50%）/（高于50%病变率的百分数-低于50%病变率的百分数）X：lgTCID50=距离比例×稀释度对数之间的差+高于50%病变率的稀释度的对数TCID50=10-X/0.1ml含义：将该病毒稀释10X接种100µl可使50%的细胞发生病变。示例：细胞病变情况统计及致病百分率计算细胞对照组10-1110-1010-910-810-710-610-510-410-310-210-14病毒液稀释度出现CPE孔数无CPE孔数累计出现CPE孔所占的%无CPE孔数CPE孔数10-180049100%10-280041100%10-380033100%10-47112596.2%10-56231885.7%10-64471263.2%10-75310844.4%10-82616315.8%10-9172314.2%10-1010-11008831390000②按照Reed-Muench计算法计算TCID50（本实验用100TCID50/0.1mL）=0.7TCID50数=0.7×1+6=6.7TCID50=10-6.7/0.1mL也既是说，此病毒之10-6.7接种100µL可使一批细胞有50%病变的可能性。