第七章-有机溶剂中的酶催化作用1

武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室第七章有机溶剂中的酶催化作用1、酶非水相催化的几种类型2、有机介质反应体系3、有机溶剂中酶催化作用的影响因素4、有机介质中酶催化的应用GoGoGoGo武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室水是酶促反应最常用的反应介质。但对于大多数有机化合物来说，水并不是一种适宜的溶剂。因为许多有机化合物(底物)在水介质中难溶或不溶。由于水的存在，往往有利于如水解、消旋化、聚合和分解等副反应的发生。是否存在非水介质能保证酶催化？？1984年，克利巴诺夫（Klibanov）等人在有机介质中进行了酶催化反应的研究，他们成功地在利用酶有机介质中的催化作用，获得酯类、肽类、手性醇等多种有机化合物，明确指出酶可以在水与有机溶剂的互溶体系中进行催化反应。武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室长期以来，人们一直认为酶是水溶性生物大分子，只能在水溶液中发挥其催化功能，而有机介质会使酶活性丧失。这种传统思想极大地限制了酶学的发展。1984年ZaksA和KlibanovA.M首次发表了关于非水相介质中脂肪酶的催化行为及热稳定性的研究报道，引起了广泛的关注。传统的酶学领域迅速地产生了一个全新的分支——非水酶学(nonaqueousenzymology)。武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室早在２０世纪初，Ｅ.Ｂourquelot等曾经将乙醇、丙酮类的有机溶剂加到酶的水溶液中，进行非水介质中酶催化的尝试。１９６６年以来Ｆ.Ｒ.Ｄostoli和Ｓ.Ｍ.Ｓiegel分别报道过胰凝乳蛋白酶和辣根过氧化物酶在几种非极性有机溶剂中具有催化活力。１９７５～１９８３年间Ｂ.Ｃ.Ｂuckland和Ｋ.Ｍartinek等做了将微生物细胞、游离酶和固定化酶用于有机溶剂中合成酯和类固醇及甾醇转化的探索。一、非水介质酶催化发展情况第一节酶非水相催化的概况武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室直到１９８４年，非水溶剂中酶催化的研究才取得了突破性的进展。此后十几年来，酶在非水介质中催化反应的研究十分活跃。武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室二、酶非水相催化的几种类型有机介质中的酶催化有机介质中的酶催化是指酶在含有一定量水的有机溶剂中进行的催化反应。适用于底物、产物两者或其中之一为疏水性物质的酶催化作用。气相介质中的酶催化适用于底物是气体或者能够转化为气体的物质的酶催化反应。武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室超临界介质中的酶催化温度及压力均处于临界点以上的液体叫超临界流体(supercriticalfluid)。超临界流体的许多物理化学性质介于气体和液体之间，并具有两者的优点，如具有与液体相近的溶解能力和传热系数，具有与气体相近的黏度系数和扩散系数。同时它也具有区别于气态和液态的明显特点：（1）可以得到处于气态和液态之间的任一密度；（2）在临界点附近，压力的微小变化可导致密度的巨大变化。武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室离子液介质中的酶催化离子液（ionicliquids）是由有机阳离子与有机（无机）阴离子构成的在室温条件下呈液态的低熔点盐类，挥发性低、稳定性好。酶在离子液中的催化作用具有良好的稳定性和区域选择性、立体选择性、键选择性等显著特点。与传统的有机溶剂不同的是，离子液体没有蒸汽压，但是有很好的溶解性，热稳定范围很宽，超过液态温度范围（≤300℃）。武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室第二节有机介质反应体系微量水－非极性有机溶剂(微水介质体系)用非极性有机溶剂取代所有的大量水，使固体酶悬浮在有机相中。酶的状态可以是结晶态、冻干状态、沉淀状态，或者吸附在固体载体表面上。水－与水互溶有机溶剂（均一体系）有机溶剂与水形成均匀的单相溶液体系。酶、底物和产物都能溶解在这种体系中。水－非极性有机溶剂（两相体系）由含有溶解酶的水相和一个非极性的有机溶剂(高脂溶性)相所组成的两相体系。胶束体系和反胶束体系“水包油”和“油包水”一、常见的有机介质体系武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室EEES非水相E（正）胶束体系：表面活性剂的极性段朝外，非极性端朝内，反应时酶在胶束外面的水溶剂中，疏水性的底物或产物在胶束内部。反应在胶束的两相界面进行。反胶束体系：表面活性剂的极性端朝内，非极性端朝外，水溶液包在胶束内部。反应时，酶分子在反胶束内部的“小水池”中进行催化。........水相S胶束体系反胶束体系武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室不管采用何种有机介质反应体系，酶催化反应的介质中都含有机溶剂和一定量的水。它们都对催化反应有显著的影响。表面活性剂：表面活性剂是由亲水憎油的极性基团和亲油憎水的非极性基团两部分组成的两性分子。在有机相酶反应中用得最多的是阴离子表面活性剂：AOT(AerosolOT)，其化学名为丁二酸-2-乙基酯磺酸钠。武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室三、有机相酶反应的优点1．有利于疏水性底物的反应，增强反应物的溶解度；2．可提高酶的热稳定性；3．能催化在水中不能进行的反应；4．可改变反应平衡移动方向；5．可控制底物专一性；6．可防止由水引起的副反应；７．酶和产物易于回收；８．可避免微生物污染。武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室四、有机相酶反应具备条件1．保证必需水含量。2．选择合适的酶及酶形式。3．选择合适的溶剂及反应体系。4．选择最佳pH值。武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室第三节有机溶剂中酶催化作用的影响因素一、水对有机介质中酶催化反应的影响有机介质中的水含量多少对酶的空间构象、酶的催化活性、酶的稳定性、酶的催化反应速度等都有密切关系，水还与酶催化作用的底物和反应产物的溶解度有关。必需水：维持酶分子完整的空间构象所必需的最低水量。例如：凝乳蛋白酶，只需５０分子的水。多酚氧化酶，需３５０个水分子。武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室最适水含量：在催化反应速度达到最大时的水含量称为最适水含量。在实际应用时应当根据实际情况，通过实验确定最适合水含量。酶武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室二、有机溶剂对有机介质中酶催化反应的影响水溶性有机溶剂：甲醇、乙醇、丙醇、正丁醇、丙酮、乙晴等水不溶性的有：石油醚、己烷、庚烷、辛烷、苯、甲苯、氯仿、乙醚、戊醚等常用的有机溶剂：武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室（１）、极性系数lgP：即一种溶剂在正辛烷/水两相间分配系数的常用对数值，它能直接反映溶剂的疏水性。极性系数越大，表明其极性越弱，极性系数越小，则极性越强。一般选用2≤lgP≤5的有机溶剂。1、选择有机溶剂必须考虑的因素２、有机溶剂与反应的匹配性（即相容性）例：对于酶促糖改性而言，使用疏水性的，与水不互溶的溶剂是不现实的，因为不溶性底物和不溶性的酶之间无相互作用，必须用亲水性的溶剂（如吡啶或二甲基甲酰胺）武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室（３）、溶剂的密度、黏度、表面张力、毒性、废物处理和成本等（溶剂因底物而宜）。（2）、选择的溶剂对主反应必须是惰性的，即不参与主反应。例如，醇与酯之间发生的酯基转移反应或新醇和新酯，就不能用醇也不能用酯作为溶剂。武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室2、有机溶剂对酶结构和功能的影响（1）对酶分子表面结构的影响（2）对酶活性中心底物结合位点的影响3、有机溶剂对酶分子表面结合水的影响有机溶剂的极性越强，越易于夺取酶分子表面的结合水，对酶活性的影响就越大。例如，正己烷能夺取酶分子0.5%的结合水，甲醇则可以夺取酶分子60%的结合水。武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室4、有机溶剂对酶作用底物和产物的影响有机溶剂能改变酶分子必需水层中底物和产物的浓度。武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室三、酶的应用形式１、干酶粉和结晶酶目前最简单的也是被大多数研究者所采用的非水催化的体系是将固态酶粉直接悬浮在有机溶剂中。２、固定化酶酶固定化后，增大了酶与底物接触的表面，在一定程度上可以提高酶在有机溶剂中的扩散效果和热力学稳定性，有利于酶的回收和连续化生产。３、化学修饰酶双亲分子共价修饰或非共价修饰酶分子表面，可以增加酶表面的疏水性，使酶均一地溶于有机溶剂。武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室４、印迹酶将酶在含配体的水溶液中冻干，再将配体彻底洗去，经过这样处理的酶叫印迹酶。“pH记忆”：在有机介质反应体系中，酶所处的pH环境与其在冻干或吸附到载体之前所用的缓冲液pH相同，这种现象称为“pH记忆”。利用酶的这种pH记忆特性，可以通过控制缓冲液中pH值的方法，来控制有机介质中酶催化反应的最适pH值。武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室５、反相胶束反相胶束既是一种反应体系，也是一种酶的使用形态。“pH忘记”：用疏水性的酸或碱与他们相应的盐所组成的混合物，作为有机相的缓冲液，他们控制着有机相中酶的解离状态，使酶完全“忘记”干燥它所处的水溶液的pH。武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室第四节有机介质中酶催化的应用酶在非水介质中可以催化多种反应。可以生成一些具有特殊性质与功能的产物，在医药、食品、化工、功能材料、环境保护等领域具有重要应用价值，显示出广阔的应用前景。一、手性药物的拆分手性化合物：是指化学组成相同，而其立体结构互为对映体的两种异构体化合物一种有显著疗效，另一种有疗效弱或无效一种有显著疗效，另一种有毒副作用两种对映体的药效相反两种对映体具有各自不同的药效两种消旋体的作用具有互补性武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室药物名称有效对映体的作用另一种对映体的作用普萘洛尔（Propranolol）萘普生（Neproxen）青霉素胺（Penicillamine）羟基苯哌嗪(Dropropizine)反应停（Thalidomide）酮基布洛芬（Ketoprofen）喘速宁（Trtoquinol）乙胺丁醇（Ethambutol）萘必洛尔（Kebivolol）S构型，治疗心脏病,β-受体阻断剂S构型，消炎、解热、镇痛S构型，抗关节炎S构型，镇咳S构型，镇静剂S构型，消炎S构型，扩张支气管S,S构型，抗结核病右旋体，治疗高血压,β-受体阻断剂R构型，钠通道阻滞剂R构型，疗效很弱R构型，突变剂R构型，有神经毒性R构型，致畸胎R构型，防治牙周病R构型，抑制血小板凝集R,R构型，致失明左旋体，舒张血管武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室这些孩子出生时就四肢短小，像海豹。这是因为他们的妈妈在怀上他们的早期，往往是刚刚怀孕的头3个月，吃了一种人工合成的叫“反应停”的药，这是一种在50年代末60年代初全球46个国家(主要是西方国家、日本、一些南美和非洲国家)最为广泛使用的抗妊娠反应的药物。中国因正被西方国家围堵，幸免于难。全球共有大约1万2千个这种四肢短小的孩子，现在他们大都已人到老年。因为四肢短小，他们的生活很难自理。不幸的是，这些海豹肢症的患者结婚后生下的孩子也可能出现一模一样的症状!人类由于自身的原因造成的灾难有时竟要下一代来承担!武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室1992年，美国FDA明确要求对于具有手性特性的化学药物，都必需说明其两个对映体在体内的不同生理活性、药理作用以及药物代谢动力学情况。许多国家和地区也都制定了有关手性药物的政策和法规。这大大推动了手性药物拆分的研究和生产应用。目前提出注册申请和正在开发的手性药物中，单一对映体药物占绝大多数。武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室环氧丙醇衍生物的拆分：可以用于合成β－阻断剂、艾滋病毒蛋白酶抑制剂、抗病毒药物等多种手性药物。其消旋体可以在有机介质体系中用酶法进行拆分，获得单一对映体。如用猪胰脂肪酶。芳基丙酸衍生物的拆分：其单一对映体衍生物是多种治疗关节炎、风湿病的消炎镇痛药物的活性成分。用脂肪酶在有机介质体系中进行消旋体的拆分，可以得到Ｓ－构型的活性成分。武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室二、酚树脂的合成酚树脂是一种广泛应用的酚类聚合物，可以用作黏合剂、化学定影剂等。辣根过氧化物酶在二氧六环与水混溶的均一介质体系中，可以催化苯酚等酚类物质聚合，生成酚