实验二--沉淀试验

实验二沉淀试验目的要求1、掌握炭疽杆菌环状沉淀试验的操作技术和结果观察。2、掌握炭疽杆菌琼脂扩散试验的基本操作技术和结果观察。沉淀试验：可溶性抗原（如细菌的外毒素、内毒素、菌体裂解液、病毒、组织浸出液等）与相应的抗体结合后，在适量电解质存在下，形成肉眼可见的白色沉淀，称为沉淀试验抗原——沉淀原抗体——沉淀素沉淀试验的类型：液相沉淀试验环状沉淀试验絮状沉淀试验固相沉淀试验琼脂凝胶扩散试验免疫电泳技术实验材料1、炭疽沉淀血清由兽医生物药品厂生产供应。该血清是由免疫的马血清分离。首免用炭疽芽孢苗，再以炭疽强毒的死菌按3～4d的间隔，进行3～4次加强免疫，抗体效价达到要求时，采血分离血清。2、炭疽沉淀抗原由兽医生物药品厂生产供应。3、待检抗原冷浸法用于待检皮张，检样置37C温箱烘干，高压灭菌后，剪成小块称重，然后加入5～10倍的石炭酸生理盐水，放室温浸泡18～24h，用滤纸过滤2～3次，使之呈清朗的液体，即为待检抗原。热浸法用于待检的组织脏器，取怀疑死于炭疽病畜的脏器（脾、肝、肾、血液或肌肉等），放入乳钵内研磨碎，加5～10倍生理盐水，装入试管或小三角瓶中，煮沸30～40min，冷却后用滤纸过滤数次，直到滤液透明，即为待检抗原。4、生理盐水（一）炭疽环状沉淀试验方法与步骤:①取3支口径0.4cm的小试管，在其底部各加约0.1ml的炭疽沉淀血清。②取其1支，用毛细管将待检抗原沿着管壁重叠在炭疽沉淀血清之上，上下两液间有整齐的界面，注意勿产生气泡。③另2支小试管，一支加炭疽阳性抗原，另一支加生理盐水，作为对照。（如图）炭疽环状沉淀试验加样式意图④结果判定5～10min内判定结果，上下重叠两液界面上出现乳白色环者，为炭疽阳性。对照组中，加炭疽阳性抗原者应出现白环，而加生理盐水者应不出现白环。（二）炭疽琼脂扩散试验方法与步骤：①琼脂板制备称取1g琼脂粉，加至100ml0.5%石炭酸生理盐水中，煮沸使之溶解。待温度降至55℃左右时浇玻板，厚约2～3mm左右。②打孔在琼脂凝胶上打梅花孔，孔径为2mm，中间孔和周围孔间的距离大约为3mm。③加样中间孔加炭疽沉淀血清，周围孔中分别加炭疽沉淀抗原、待检抗原及盐水。（如图）炭疽琼脂扩散试验加样式意图④作用将琼脂凝胶板放置湿盒中，于37℃扩散24～72h，每天观察结果，观察三天。⑤结果观察抗原抗体扩散时，在两孔间比例最合适的位置出现白色沉淀线，出现白色沉淀线即为阳性反应，不出现白色沉淀线为阴性反应。炭疽琼脂扩散试验结果