一、免疫沉淀类试验

第一部分免疫沉淀类实验微生物与免疫教研室一、抗原抗体制备技术•抗体：是B淋巴细胞接受抗原激活后增殖分化为浆细胞所合成分泌的一类能与相应抗原特异性结合的、具有免疫功能的球蛋白。•单克隆抗体：由一种抗原决定簇刺激机体，由一个B淋巴细胞接受该抗原所产生的抗体。•多克隆抗体：由多种抗原决定簇刺激机体，相应地就产生各种各样的单克隆抗体，这些单克隆抗体混杂在一起就是多克隆抗体，机体内所产生的抗体就是多克隆抗体。抗体制备分三个阶段•抗原的制备与纯化1.抗原的制备与纯化•动物免疫2.动物的选择•血清分离纯化与鉴定抗原抗原：是一类能够诱导机体免疫应答并能与相应抗体或T细胞受体发生特异反应的物质。具有免疫原性和免疫反应性。•不同的抗原，其免疫原性的强弱均不相同，这种免疫原性的强弱取决于抗原的分子量、化学活性基团、立体结构、物理形状和弥散速度等。a.根据抗原性不同，分为完全抗原和不完全抗原。b.根据化学性质分为蛋白质抗原、类脂抗原、多糖抗原和核酸抗原。c.根据物理性状分为颗粒性抗原和可溶性抗原。常见的颗粒性抗原主要是细菌或动物细胞。返回动物的选择•动物的选择常根据抗体的用途和量来决定，也与抗原的性质有关。•一般，抗原来源与动物种属差异越大，免疫原性越强，免疫效果越好。•免疫用的动物需选择适龄、健康、体重合适的动物，最好为雄性。由于对免疫应答的个别差异，免疫时应同时选用数只动物进行免疫。•实验室制备抗体，多选用家兔和绵羊。抗原剂量的选择•小鼠首次抗原剂量为：50-400μg/次•大鼠为100-1mg/次•兔子为200-1mg/次•加强免疫的剂量为首次剂量的1/5-2/5途径•免疫剂量与注射途径有关，一般而言，静脉注射剂量大于皮下注射，而皮下注射又比掌内和跖内皮下注射剂量大，也可采用淋巴结内注射法。绵羊红细胞的制备流程图摇动15-20min4℃可保存3周取适量NS洗涤3次2000r/min10minNS稀释至2～5%细菌细胞抗原的制备流程图液体培养或斜面培养37℃24h100℃水浴45min杀菌无菌试验O菌体抗原返回颗粒性抗原多克隆抗体的制备--伤寒杆菌O抗血清的制备1、伤寒杆菌O抗原的制备：接种37℃18-24h洗下菌苔（用含0.5%苯酚的NS）100℃45min离心4000rpm,10min得到原液稀释109/ml应用液2、免疫方法：选择体重2-3kg的健康家兔，将已经稀释好的抗原按下列剂量及程序做皮内或静脉注射。第一天注射1ml，第8天注射1.5ml，第15天注射2ml，末次注射后7天颈动脉放血，测效价。可溶性抗原多克隆抗体的制备第一次免疫（基础免疫）第一次加强免疫第二次加强免疫效价测定（双扩）2-4周2-3周7天佐剂•概念：预先与抗原同时注入体内，可增强机体对该抗原的免疫应答或改变免疫应答类型的非特异性免疫增强性物质。•种类：一种本身具有免疫原性，如百日咳杆菌、抗酸杆菌（结核分枝杆菌）以及革兰阴性杆菌等；另一种本身无免疫原性，如氢氧化铝、磷酸钙、矿物油乳剂、表面活性剂等。目前应用最多的是弗氏佐剂。佐剂•主要作用机制：①改变抗原物理性状，延缓抗原的降解和排除，延长抗原在体内滞留的时间②刺激单核-巨噬细胞系统，增强其对抗原的处理和提呈能力③刺激淋巴细胞的增殖分化，从而增强和扩大免疫应答的能力弗氏佐剂动物实验中最常用的佐剂：①弗氏不完全佐剂(incompleteFreund'sadjuvantIFA)羊毛脂1份+石蜡油5份，混合，高压灭菌后保存。用时加热融化，冷却至50℃左右，加抗原进行乳化处理。②弗氏完全佐剂(completeFreund'sadjuvant,CFA)弗氏不完全佐剂10ml+卡介苗10mg～200mg卡介苗可100℃10min灭活处理。免疫乳剂制备成功的判别标准•油包水状态鉴定方法是将乳化剂滴入4℃左右冷水中，若保持完整不分散，成滴状浮于水面，即乳化完全，为合格的油包水剂。免疫•将制成的乳剂吸入注射器，在兔子背部及颈部皮下注射8-10点，每点约0.2ml•每隔14天用初次用量的2/5的抗原于不完全抗原中，在皮下多点注射加强免疫,每点0.2ml,共加强2次.•第二次加强免疫开始,在免疫后第7天用免疫双扩散法检查抗体效价.抗体的分离鉴定及保存•见教材p22-26二、沉淀反应（precipitation）是可溶性抗原与相应抗体在适当条件下发生特异性结合所出现的沉淀现象。沉淀反应的特点•抗原为可溶性物质，如蛋白质、多糖•沉淀反应分两个阶段：–第一阶段、抗原抗体特异性结合–第二阶段、形成可见的免疫复合物分类液体内沉淀试验絮状沉淀试验环状沉淀试验免疫浊度测定凝胶内沉淀试验免疫扩散免疫电泳单向免疫扩散试验双向免疫扩散试验火箭免疫电泳对流免疫电泳沉淀反应1.絮状沉淀反应（flocculation）•絮状沉淀试验是一项经典实验技术。•代表试验：曾用于测定梅毒抗体的Kahn试验，现今已被更简便而敏感的血清不加热反应素试验(USR)或快速血浆反应素环状卡片试验(RPR)方法替代。原理：抗原溶液与相应抗体溶液混合，在电解质存在的条件下，抗原与抗体结合出现可见的絮状沉淀。絮状沉淀试验方法简单，设备要求低，敏感度较低，受抗原抗体比例影响非常明显，目前多用以测定抗原抗体反应的最适比。2.环状沉淀试验(ringprecipitation)1902年，Ascoli建立的一种经典的血清学定性试验。用非常简便的技术了解待测血清内是否存在某种抗原或抗体。原理：把抗原溶液小心地加于已含抗体溶液的细试管液面上。当对应的抗原与抗体相遇，在界面处形成清晰的乳白色沉淀环。方法评价该试验是经典的血清学反应之一，简便、快速、实用。环状试验中抗原、抗体溶液须澄清。该试验主要用于鉴定微量抗原，如法医学中鉴定血迹，流行病学用于检查媒介昆虫体内的微量抗原等，亦可用于鉴定细菌多糖抗原。(诊断炭疽的Ascoli试验)。只能定性，不能定量、敏感性较低(3~20mg/L)，对含有多个抗原抗体对的反应系统缺乏分辨力。方法难以推广。3.免疫浊度测定经典的沉淀试验有4个缺点无法克服：①操作繁琐②敏感度低（10～100μg/ml）③时间长④难以自动化（1）免疫浊度分析的基本原理：•抗原、抗体在特定的电解质溶液中反应，形成小分子免疫复合物(19S)，在增浊剂(如PEG、NaF等)的作用下，迅速形成免疫复合物微粒(19S)，使反应液出现浊度。在抗体稍微过量且固定的情况下，形成的免疫复合物量随抗原量增加而增加，反应液的浊度亦随之增大，即待测抗原量与反应溶液的浊度呈正相关。用一系列已知浓度的抗原标准品同时进行试验，制备剂量反应曲线，即可计算出标本中抗原的含量（2）类型透射免疫比浊法散射免疫比浊法免疫胶乳比浊法透射免疫比浊法原理：抗原抗体在一定缓冲液中形成免疫复合物(IC)，当光线透过反应溶液时，由于溶液内复合物粒子对光线的反射和吸收，引起透射光减少，免疫复合物量越多，透射光越少，即光线吸收越多，可用吸光度表示。吸光度和复合物的量成正比，当抗体量固定时，与待检抗原量成正比。用抗原标准品建立标准曲线，可测出待检抗原含量。方法评价：优点：①灵敏度比单扩法高5—10倍；②CV小于10％；③操作简便快速，1h可报告结果；④结果准确，且能用全自动化或半全自动化仪器进行分析，尤其随着胶乳粒子增强浊度测定法的出现，使敏感度提高，其应用更加广泛。缺点：①抗体用量较大；②检测需抗原抗体反应达到平衡，耗时较长；③不宜用于药物等半抗原的测定；④灵敏度较散射比浊法低。散射免疫比浊法原理：散射光系指一定波长的光沿水平轴照射，碰到小颗粒的免疫复合物，光线被折射，发生偏转，这种偏转的角度可因光线波长和颗粒大小不同而有所区别。散射浊度法是在入射光的一定角度检测粒子发出的散射光，散射光的强度与复合物的含量呈正比，即待测抗原越多，形成复合物越多，散射光强度越强。又可分为速率散射比浊法(ratenephelometry)和终点散射比浊法(endpointnephelometry)。免疫胶乳比浊法原理选择一种大小适中，均匀一致的胶乳颗粒，吸附抗体后，当遇到相应抗原时，则发生凝集，单个胶乳颗粒在入射光波长之内，光线可透过，当两个胶乳凝集时，则使透过光减少。这种减少的程度与胶乳凝集成正比，与抗原量成正比。（a）带抗体的胶乳在波长之内可透过光线；（b）结合后，则形成光线衰减方法评价敏感度高，试剂稳定，因反应液中无PEG沉淀剂的影响，个体IC对结果影响也小，所以结果稳定、可靠，特异性好；不需特殊仪器设备，一般分光光度计、自动化生化分析仪或散射比浊仪均可使用。总评价缺点：测定结果与仪器的性能和试剂的质量密切相关，特别对抗体的质量要求高，仪器和试剂价格比较贵。优点：①自动化②快速(30～60s)③灵敏(μg/L)④准确⑤精密度高(CV5％)⑥稳定性好⑦节省试剂⑧检测范围广⑨不需减去样本和试剂本底值等优点。免疫比浊测定的影响因素1.抗原抗体比例2.抗体的质量3.抗原抗体反应的溶液4.增浊剂的使用抗原抗体比例1.高剂量钩状效应（highdosehookeffect)2.海德堡（heidelberger）曲线理论抗体的质量（1）特异性高（2）效价高（3）亲和力高（4）抗血清来源抗原抗体反应的溶液•pH6.5~8.5•电解质离子强度、种类（磷酸盐缓冲液）增浊剂的使用•PEG、tween-20等非离子型亲水剂•作用：消除蛋白质分子周围的电子云和水化层，促进抗原、抗体分子靠近，结合形成大分子复合物。三、凝胶内沉淀试验(gelphaseprecipitation)主要是指琼脂糖扩散或称凝胶扩散(geldiffusion)。常用的凝胶有琼脂、琼脂糖、葡聚糖或聚丙稀酰胺凝胶等。★根据实验目的与方法不同，可将固相内沉淀验分为2类：（一）免疫扩散①单向免疫扩散试验(singlegeldiffusiontest)②双向免疫扩散试验(doublegeldiffusiontest)（二）凝胶免疫电泳(gelimmuno-electrophoresis)火箭免疫电泳对流免疫电泳（一）单向免疫扩散试验原理：将一定量的抗体混入琼脂凝胶中，使待测的抗原物质在凝胶中自由扩散，与抗体结合形成沉淀环，沉淀环的大小与抗原浓度呈正相关。是一种稳定、简便、毋需特殊设备，一般实验室均可使用的常规方法，试验的重复性和线性均好。敏感度为1.25mg/L。操作步骤1.将抗体和0.9%琼脂糖50-56℃混合,即刻倾注成平板。2.待凝固后在琼脂板上打孔,孔中加入已稀释的抗原溶液和不同浓度的抗原标准品溶液。3.置37℃,让其向四周自由扩散,24-48h后可见其孔周围出现沉淀环。单向辐射状免疫扩散上排为5个不同的参考，中、下排为患者血清，下排右2为一异常病理血清影响因素1.抗原分子量抗原分子量大，扩散慢，沉淀环较小；抗原分子量小，扩散快，沉淀环相对较大。要求待检血清和抗原标准品在血清学上具有均一性，否则可能出现结果偏高或偏低。2.抗体种类实验证明兔抗血清优于马、羊抗血清，兔抗血清可测抗原0.1~1IU/ml，马抗血清为1~10IU/ml，羊为0.4~4IU/ml，为提高实验敏感度，应首选敏感度高的抗血清。3.抗体稀释度抗体浓度大，沉淀环小，则敏感度低；抗体浓度小，沉淀环增大，不同浓度抗原间的差别较显著，敏感度高。但沉淀环过大，常造成边缘糊不清，致使测量误差也增大。因此要求在沉淀环清晰的基础上加大稀释度以提高敏感度。下图为抗体分别以1:25、1:50、1:75、1:100稀释，所形成的4条标准曲线。（二）双向琼脂扩散试验1.原理：将可溶性抗原和抗体置于琼脂凝胶板的对应孔中，两者各自在凝胶中向四周自由扩散，当抗原与抗体相遇，在比例合适时形成可见的白色沉淀线。沉淀线的特征与抗原抗体的浓度、纯度和扩散速率等有关。2.操作步骤1）融化琼脂，浇板每张载玻片约5-6ml。2）凝固，打孔孔径3mm，孔间距3~5mm，孔型有双孔型、三角孔型、双排孔型和梅花孔型。3）加样在相对孔内加抗原或抗体。4）孵育使抗原抗体自由扩散，在两孔之间抗原抗体相遇，在比例适时形成可见的沉淀线。沉淀线的数目、形态和位置与抗原和抗体的纯度、浓度和