免疫沉淀试验

第六章免疫沉淀试验教学目的掌握：液相内沉淀试验、凝胶内沉淀试验原理熟悉：沉淀反应的特点、免疫电泳技术、沉淀反应的应用一、基本原理免疫沉淀反应（immunoprecipitationreaction）指可溶性抗原与相应抗体在适当条件下发生特异性结合而出现的沉淀现象。第一节免疫沉淀试验的基本原理形成肉眼可见的大的免疫复合物。第一阶段第二阶段沉淀反应分两个阶段抗原抗体特异性结合，快速但不可见环状沉淀试验絮状沉淀试验免疫浊度测定免疫扩散试验免疫电泳技术液体内沉淀试验凝胶内沉淀试验二、免疫沉淀试验的分类1.阶段性2.特异性3.抗原性质：可溶性4.抗体的选择：2价三、免疫沉淀试验的特点第二节液体免疫沉淀试验一、絮状免疫沉淀试验絮状免疫沉淀试验是将抗原与相应抗体混合，在电解质存在的条件下，抗原抗体结合形成肉眼可见的絮状沉淀物。第二节液体免疫沉淀试验抗原稀释法：抗原最适比例抗体稀释法：抗体最适比例方阵滴定法：抗原抗体最适比例一、絮状免疫沉淀试验1:21:41:81:161:321:641:128各管抗原倍比稀释加入抗血清各管抗体量不变振摇混匀、37℃孵育沉淀量不同出现沉淀量最多的管为最适比例管。轻摇絮状沉示意图淀AgAbAg最适比方阵测定法抗体稀释度抗原稀释度1/101/201/401/801/1601/3201/640对照1/5++++++++++++±—1/10+++++++++++++—1/20+++++++++++++—1/40—±+++++++++—1/80————+++—原理：当可溶性抗原与相应抗体特异结合，二者比例合适时，在增浊剂中它们快速形成一定大小的抗原抗体复合物，使反应液体出现浊度。二、免疫浊度测定优点：稳定性好、简便快速，易于自动化敏感度高精确度高无放射性核素污染1.根据反应的时间和反应结合的动力学分为速率比浊法终点比浊法2.根据检测仪器的位置及光信号性质分为透射免疫比浊法散射免疫比浊法3.免疫胶乳比浊法分类：透射比浊试验和散射比浊试验光路检测器A检测器BICI0IθIθ透射比浊试验散射比浊试验当复合物＜3×106dal，I≈Iθ;θ＜90°，散射光的量代表IC的量。（1）抗原抗体的比例：反应体系保持抗体过量（2）抗体的质量：特异性强，效价高，亲和力强，并使用R型抗体（3）抗原抗体反应液的环境：最适PH为6.5-8.5（4）增浊剂补充：免疫浊度测定影响因素（1）抗原抗体的比例在抗体过量的反应体系中,抗原量的递增与比浊定量成正比,当抗原抗体比例合适时反应达峰值,而当抗原过量时,形成的免疫复合物分子小,浊度反而下降的一个抛物曲线。海德堡曲线（2）抗体的质量•抗体的特异性•抗体的效价(1:20)•抗体的亲和力•R型和H型抗体（R型）（3）抗原抗体反应的环境最适PH为：6.5-8.5离子强度大，IC形成快离子种类的影响，常用磷酸盐缓冲液（4）增浊剂PEG(6000—8000)浓度4%吐温-201.抗血清中有非特异性的交叉反应性杂抗体成分2.增浊剂浓度和反应时间掌握不当3.样品本身的浊度处理不当4.试剂污染变质5.比色杯不够清洁伪浊度形成的原因第三节凝胶内免疫沉淀试验第三节凝胶内免疫沉淀试验可溶性抗原和相应抗体在凝胶中扩散，形成浓度梯度，在抗原抗体相遇并且浓度比例适当的位置形成肉眼可见的沉淀线或沉淀环。原理反应介质：凝胶凝胶的特点：1、固相的液体2、多孔的网状结构3、Ag-Ab复合物网络在凝胶中原理：抗体与待测的抗原,在两者比例合适的部位结合形成沉淀环。环的大小与抗原的浓度成正相关。技术要点：1.制板2.打孔3.加样4.扩散5.绘制标准曲线定量试验一、单向免疫扩散试验倾注平板打孔加样放置37℃24～48h观察沉淀环一、单向免疫扩散试验T1为16-24h；T2为24-48h；T3为48h以上,可见T3为直线，T1为反抛物线t1为16-24h；t2为24-48h；t3为48h以上,可见t1为直线，t3为反抛物线Mancini曲线Fahey曲线待检蛋白质抗原须具备的条件仅针对某待测抗原的单价特异性抗血清已知含量的标准品待测品含量在1.25g/ml以上单向扩散试验上排为5个不同浓度的参考品；下排为患者血清，下排右2为异常病理血清一、单向免疫扩散试验应用IgG、IgA、IgM、C3、C4、转铁蛋白、抗胰蛋白酶、糖蛋白和前白蛋白等多种血浆蛋白的检测技术要点：1.制板2.打孔3.加样4.扩散二、双向免疫扩散试验1.判断抗原或抗体的存在以及估计相对含量2.分析抗原或抗体相对分子量二、双向免疫扩散试验3.分析抗原的性质二、双向免疫扩散试验4.滴定抗体的效价5.鉴定抗原或抗体纯度二、双向免疫扩散试验应用1.AFP检测的最早方法2.血清中含量较高的酶类、细菌病毒感染后血清中产生的抗体的检测三、免疫电泳技术优点：1.加快反应的速度。2.提高了灵敏度。3.增加了分辨率。电泳分析＋沉淀反应抗原抗体反应的高度特异性电泳技术的高分辨率、快速、微量三、免疫电泳技术•电泳（electrophoresis）：在外加电场的作用下带电颗粒向着其电性相反的电极移动，称为电泳。电泳迁移率：定义：同一电场条件下，各种带电粒子在单位时间内移动的距离。M=cm2/VS影响泳动的速度的因素:本身净电荷量、颗粒大小、形状电场强度溶液pH值溶液离子强度电渗电渗：电场中液体相对于固体的运动①载体的性质②缓冲液的离子强度③电泳时的电压电渗方向与样品运动方向一致：样品迁移率加快电渗方向与样品运动方向不一致：样品迁移率降低，甚至倒退电泳载体：琼脂琼脂糖凝胶常用浓度：0.8%-1.0%特点:杂质少、接近电中性，常温易凝固，色泽透明、质地均匀、富有弹性。蛋白质的两性解离性质：--NH2+H2O--NH3++OH---COOH--COO-+H+两性离子pH=pI电中性，无电泳移动性pHpI酸性溶液带正离子，向阴极泳动pHpI碱性溶液带负离子，向阳极泳动原理：双向扩散+电泳实质上是定向加速度的免疫双扩散技术比双向扩散试验灵敏度提高8∼16倍（一）对流免疫电泳通电－蛋白质抗原常带较强的负电荷，在电场中向正极移动抗体球蛋白带负电荷较少，籍电渗作用向负极泳动＋（一）对流免疫电泳结果分析：无沉淀线出现则表明无相应的抗原。沉淀线位于抗原抗体孔中间，说明两者比例较适合。（一）对流免疫电泳技术评价：1.简便、快速,敏感度较双扩提高8-16倍，可测蛋白质浓度达ug/ml.2.要求抗原、抗体比例严格3.不适宜抗原抗体都是球蛋白的检测抗原抗体分子复合物形成的沉淀线逐渐变窄，形成一个形状如火箭的不溶性复合物沉淀峰，抗体浓度固定时，峰的高度与抗原量呈正相关。单向免疫扩散＋电泳,定量检测技术（二）火箭免疫电泳1.2%巴比妥琼脂糖约55℃，加入适量抗血清，混匀后制板，打孔，孔内加待测样品，样品孔放负极侧，6h后观察琼脂板上沉淀峰，绘制标准曲线，求出待测样品浓度。技术要点（二）火箭免疫电泳火箭免疫电泳图①②③④为标准抗原；⑤⑥为标本-+（二）火箭免疫电泳示意图结果判定：1、定性：直接观察、染色2、定量：根据峰高-浓度标准曲线计算3、为提高灵敏度，可加入少量125I标记的标准抗原共同电泳，则可在含抗体的琼脂中形成不可见的火箭峰原理：区带电泳＋双向扩散1、将蛋白质抗原在凝胶中电泳分成肉眼不可见的若干区带2、沿电泳方向挖一与之平行的抗体槽，加入相应抗血清进行双向扩散（三）免疫电泳根据各蛋白所处的电泳位置,可分为:白蛋白区、球蛋白区、1区、2区、区、区+--ALB12白蛋白抗胰蛋白酶触珠蛋白转铁蛋白IgG前白蛋白酸糖蛋白铜蓝蛋白C3aC3bCRP1脂蛋白抗糜蛋白酶巨球蛋白1.纯化抗原和抗体成分的分析2.正常及异常免疫球蛋白的识别与鉴定应用免疫电泳-+（三）免疫电泳示意图技术评价：1.分辨率较高2.仅定性3.扩散时间长，影响因素多，结果较难分析4.目前大量应用于纯化抗原和抗体成分的分析及正常和异常体液蛋白的识别与鉴定。抗原抗体在凝胶中直接发生沉淀反应，在适当位置形成抗原抗体复合物，经染色后，可对各类免疫球蛋白及其轻链进行分型原理区带电泳＋沉淀反应（四）免疫固定电泳左图为IgGκ型,中图为IgGλ型，右为正常SPGAMκλSPGAMκλSPGAMκλ（四）免疫固定电泳示意图原理：待检蛋白电泳固定剂及各类抗血清加于凝胶表面的泳道抗原与对应抗体反应沉淀漂洗染色某一抗原的存在?分辨率强，敏感度高，操作周期短，仅需数小时，结果易于分析。应用最常用于M蛋白的鉴定与分型，也用于尿中本周氏蛋白质的检测与κ、λ分型，脑脊液中寡克隆蛋白的检测与分型。优点（四）免疫固定电泳应用:M蛋白的鉴定和分型（五）交叉免疫电泳（六）自动化免疫电泳第四节免疫沉淀试验的临床应用免疫浊度法：蛋白质的检测如免疫球蛋白、补体、类风湿因子、C反应蛋白等第五节临床常用免疫沉淀试验试剂方法特点一、胶乳增强的透射免疫比浊试验在全自动生化分析仪中的应用二、胶乳增强的透射免疫比浊试验在血凝固分析仪中的应用三、免疫固定电泳在半自动电泳仪中的应用四、散射免疫比浊试验在特种蛋白免疫分析仪中的应用第六节影响免疫沉淀试验的主要因素如温度、电解质、酸碱度等名词:沉淀反应简答:1.双向免疫扩散试验的应用2.免疫电泳技术的类型思考题