细胞培养

细胞培养环境、设备、耗材与试剂1.环境：细胞培养需要创造一个尽量无菌的环境，所以基本要求是一间密闭的带有空气净化系统的实验室。实验室要安装能够进行表面杀菌的紫外灯，一般装置在室内顶部，与日光灯分开控制。2.设备：一般的细胞培养需要二氧化碳细胞培养箱，达到细胞实验操作要求的超净台，倒置显微镜，液氮罐，冰箱，水浴锅，离心机，微量移液器等。3.耗材：基本的细胞实验耗材包括酒精灯、脱脂棉花、封口胶、细胞培养瓶、细胞培养皿、移液管、50ml离心管等。耗材可以购买细胞培养专用的一次性耗材，也可使用长久性的玻璃器皿。但是如果是使用长久性的玻璃器皿，必须将其用牛皮纸包裹好，然后经过湿热高压灭菌和灭菌后烘干。牛皮纸在放进超净台时才能拆除。4.试剂：根据培养的细胞种类的不同，需要的试剂也不同。基本要求包括培养的细胞对应的培养液，胎牛血清，L谷氨酸，双抗（青霉素和链霉素），0.25%胰酶以及PBS。1.试剂可以通过生物公司订购，其中双抗、胰酶和PBS也可以自行购买原料配制。1、配制双抗时要用灭过菌的双蒸水，用一次性无菌注射器进行配制，整个配制过程要在超净台内操作。2.配制胰酶时要使用灭菌后的双蒸水，配制好可以用带0.22微米微孔滤膜的过滤器进行过滤灭菌，整个过滤灭菌过程要在超净台内操作。3.配制PBS可以使用不灭菌的双蒸水，配制完成后再经过湿热灭菌。5.部分试剂的配方1.100×L谷氨酸：L谷氨酰胺0.2M2.10×PBS：1000ml中含NaCl8.5g，Na2HPO4.12H2O30.8g，NaH2PO4.2H2O2.8g3.100×双抗：青霉素10000U/ml，链霉素10000ug/ml4.胰酶：0.25%胰酶，0.03EDTA6.细胞完全培养液的配置细胞完全培养液，以293细胞为例，需要含10%胎牛血清、2mmol/L的L谷氨酸的DMEM培养液。配置好的DMEM培养液，根据实验要求的不同，选择是否加入双抗。双抗终浓度为100单位/ml。细胞培养实验基本操作要求1.每天应该对细胞实验室进行半小时的紫外照射灭菌。紫外辐射对人体有害，灭菌时，人员不能进入细胞实验室。2.进入细胞实验室操作的人员，应该身着消毒过的白大褂，更换消毒过的拖鞋，操作有毒试剂要带好手套。外来带入的物品，都要经过紫外照射或者酒精擦拭的表面灭菌。3.裸手进行细胞操作，则要在操作之前用消毒液洗手，并在将手伸进超净台前用酒精擦拭全部手部皮肤。带橡胶手套进行细胞操作，在将手伸进超净台前也要用酒精擦拭手套的整个外表面。4.试剂要按储存要求保存，在超净台内打开过一次的试剂，储存前要用封口膜封住瓶口，并最好在封口膜上表明打开日期。5.使用超净台之前，应该将超净台的机玻璃板合上，打开超净台紫外开关进行半小时的紫外杀菌。超净台紫外灭菌完毕后，应关闭紫外开关，打开超净台通风开关，然后才能打开有机玻璃板。一般在使用超净台时，有机玻璃不能离台面太远，保持在20cm以内。6.超净台灭菌以后，任何拿进超净台的物品都要用酒精擦拭物体的全部表面，然后在酒精未干之前放进超净台。要使用到的细胞培养耗材可以在超净台灭菌前放入其中，跟超净台一起灭菌。而细胞培养要使用到的试剂则不可以放入超净台接受紫外照射。7.细胞实验要使用到的直接接触细胞的试剂，一般要在37度水浴锅中预热半小时，使其温度接近37度。8.细胞离开培养箱被进行操作的过程不宜过长，否则由于外界温度和二氧化碳浓度的不适，会导致细胞状态不好甚至死亡。9.细胞培养用的器皿，包括培养瓶、培养皿等等，要对着酒精灯的火焰打开开口，操作过程开口都要对着酒精灯火焰10cm范围内。细胞培养使用的试剂，在酒精擦拭试剂储存器皿后带入超净台。打开瓶盖之前要再用酒精棉花擦拭瓶口，然后对准酒精灯火焰打开开口。操作过程整个开口都要对着酒精灯火焰10cm范围内。10.操作过程最重要的原则是保持细胞和试剂无菌，并且避免细胞和试剂之间、试剂和试剂之间的交叉污染。比如已经将移液管伸入细胞瓶里吹打细胞，那么要再吸取新的培养液加到培养瓶中则不能再使用该移液管，一定要更换新移液管再去吸取新的培养液。尽量减少细胞和培养液暴露的时间。细胞的传代和培养（以293细胞为例)1.传代：一般贴壁细胞长满培养瓶培养面积的90%左右就应该对细胞进行传代。贴壁细胞长满培养面，就会产生接触抑制，影响细胞的状态。1.对着酒精灯火焰打开细胞培养瓶，用移液管小心吸去培养液，注意移液管不要碰到细胞层，吸液时可将细胞瓶稍微倾斜。2.吸取2-3mlPBS漂洗细胞，去掉残余血清并平衡盐离子。具体操作为：将PBS从背对着细胞层的一侧加入，倾斜培养瓶，让PBS溶液覆盖整个细胞表面，之后再把PBS溶液吸去。移液管注意不能碰到细胞层。3.吸取1-1.5ml25%胰酶加入培养瓶，将细胞从培养平面上消化下来。具体操作为：将胰酶从背对着细胞层的一侧加入，倾斜培养瓶，让胰酶溶液覆盖整个细胞表面，默数5s之后迅速把胰酶溶液吸去，残留大约0.2ml胰酶在培养瓶中。移液管注意不能碰到细胞层。将培养瓶盖上，左右倾斜培养瓶，让残余的一点点胰酶溶液再和细胞层反应。1min后轻轻拍打培养瓶侧面。如果肉眼能看见细胞层慢慢从培养平面脱落，则消化成功。否则，再加一点点新胰酶，重复操作。4.吸去2ml左右完全DMEM培养液加入培养瓶，用移液管吸取培养液和残余胰酶混合物对着培养瓶底壁进行吹打，使以消化的细胞全部脱离瓶壁并分散开来。5.根据培养的需要确定传代细胞的数量，将细胞悬浮液吸取到新的培养瓶中，再加入适量完全DMEM培养液，并再次吹打细胞。（培养液最终以盖住整个细胞培养瓶的培养面，深度3-4mm，并且不会沾染到培养瓶瓶口为准）6.最后给新培养瓶做好标记，在超净台内将盖紧的培养瓶瓶盖旋松半圈，然后放入培养箱。培养瓶瓶盖旋松是为了让培养箱内气体能进入培养瓶。2.培养：不同细胞的培养条件略有不同，293细胞的培养条件是37℃，5%二氧化碳。细胞培养液中一般含有碳酸氢钠，通过跟二氧化碳的作用来维持培养液的Ph值。培养液中一般用酚红作为Ph指示剂，如果二氧化碳不通畅，培养液偏碱性，则呈现暗红色。二氧化碳通常，培养液偏酸性，呈现橙黄色。培养液偏碱性，会造成细胞无法生长或死亡。所以可以根据培养液颜色来判断瓶盖是否拧得过紧。细胞如果长时间不传代，每隔3天应该给细胞换次培养液。细胞的冻存和复苏（以293细胞为例）1.冻存：冻存的细胞应该是处于良好的状态。1.按传代方法把细胞悬浮。2.将悬浮的细胞进行1000转的低数离心，使细胞沉淀。3.用含10%DMSO的完全培养基重新悬浮细胞，并把细胞混合液分装到冻存管中，管口最好用封口胶封住。4.细胞逐步降温有两种方法：A.传统的先把盛放细胞混合液的冻存管放入4℃10分钟，然后放负20℃，之后是负80℃过夜，最后移入液氮罐保存。B.把盛放细胞混合液的冻存管放入程序性降温盒，然后在盒子里灌满异丙醇，之后放入负80℃过夜，最后移入液氮罐保存。2.复苏：1.把从液氮罐里取出的冻存管迅速放入37℃的温水中，并不断摇晃冻存管，使其内部的细胞混合液融化。2.将冻存管中的混合液移入15ml离心管中，打开冻存管之前要用酒精擦拭冻存管管口。在离心管内迅速加入10ml完全培养液，并轻轻吹打使细胞混匀。3.1000转离心5分钟，弃上清，再加入10ml完全培养液，吹打混匀。4.1000转离心5分钟，弃上清。加入6ml完全培养液，吹打混匀后移入培养瓶内正常培养。5.第二天要给细胞换液。细胞的计数和铺板（以293细胞为例)1.计数：1.将细胞计数板和盖玻片清洗干净，并用擦镜纸吸去表面的水滴。2.把盖玻片盖在细胞计数板的计数区域。3.将细胞按传代方法悬浮，反复吹打细胞悬浮液使细胞分散均。取15微升左右的细胞悬浮液加入细胞从盖玻片和细胞板贴合的边缘加入，使其慢慢充满盖玻片与细胞板之间的空隙，注意不要留有气泡。4.把细胞计数板放至显微镜下进行细胞计数。细胞计数板有上下两个区域，每个区域包含9个大格，每个大格又被划分为16个小格。选取一个大格，计数格中的细胞总数。压线的细胞只算上侧和左侧，不算右侧和下侧。每个大格的体积是0.1μl，换算可得悬浮液的细胞浓度。2.铺板（以24孔板为例）：1.在24孔板每个板中加入0.5ml完全培养基。2.将细胞悬浮液稀释至6×105个细胞/ml，然后用1ml的枪吸取0.5ml细胞，将手抬高至枪头离细胞板3到4cm，缓慢的逐滴滴入孔中。滴液过程注意对准同一个孔的不同位置，以便让细胞分散得更均匀。3.每滴完一个孔后，应该盖上24孔板，将整个板在超净台平面，水平的前后左右的轻微振荡一下。注意不能把细胞液振到板盖或板子外面。4.将接种好的24孔板放入培养箱培养。每个孔加入3×105个细胞，是使24孔板经过12小时培养就可以盖满整个底面的细胞数量，根据实验的不同要求，可以调整加入的细胞量。其他孔板按照底面积换算。细胞培养常见问题及解决办法原因解决办法培养基颜色偏紫培养基中溶解的二氧化碳不够检查培养箱的二氧化碳水平以及确定是否培养瓶瓶口拧得过紧。细胞的状态应该在传一两次代以后才能完全恢复。微生物等造成污染在超净台内的操作过程污染受污染的细胞要丢弃，培养箱和超净台要彻底消毒除菌。在同个超净台操作过的试剂（培养基等等），应该取一些放培养瓶或皿放入消毒后的培养箱培养一周，确定是否污染，污染了就必须扔掉。如果细胞污染范围比较大，则整个细胞实验室都需要熏蒸消毒。离开超净台后暴露在空气中而受到污染需要把污染的细胞扔掉细胞状态不好，生长缓慢，漂浮死细胞多培养基营养不够，Ph值不对更换新的培养基培养，并传代一两次看细胞状态是否恢复二氧化碳浓度或温度不适检查,校准培养箱传代细胞时胰酶过量或处理时间过长调整浓度时间某些细胞对双抗耐受性较低，对外界环境比较敏感审慎处理细胞培养大全第一章细胞培养的基本原理与技术现代生物技术一般认为包括基因工程技术、细胞工程技术、酶工程技术和发酵工程技术，而这些技术的发展几乎都与细胞培养有密切关系，特别是在医药领域的发展，细胞培养更具有特殊的作用和价值。比如基因工程药物或疫苗在研究生产过程中很多是通过细胞培养来实现的。基因工程乙肝疫苗很多是以CHO细胞作为载体；细胞工程中更是离不细胞培养，杂交瘤单克隆抗体，完全是通过细胞培养来实现的，既使是现在飞速发展的基因工程抗体也离不开细胞培养。正在倍受重视的基因治疗、体细胞治疗也要经过细胞培养过程才能实现，发酵工程和酶工程有的也与细胞培养密切相关。总之，细胞培养在整个生物技术产业的发展中起到了很关键的核心作用。第一节体外培养的概念一、基本概念体外培养（invitroculture），就是将活体结构成分或活的个体从体内或其寄生体内取出，放在类似于体内生存环境的体外环境中，让其生长和发育的方法。组织培养：是指从生物体内取出活的组织（多指组织块）在体外进行培养的方法。细胞培养：是指将活细胞（尤其是分散的细胞）在体外进行培养的方法。器官培养：是指从生物体内取出的器官（一般是胚胎器官）、器官的一部分或器官原基在体外进行培养的方法。二、体内、外细胞的差异和分化1、差异：细胞离体后，失去了神经体液的调节和细胞间的相互影响，生活在缺乏动态平衡相对稳定环境中，日久天长，易发生如下变化：分化现象减弱；形态功能趋于单一化或生存一定时间后衰退死亡；或发生转化获得不死性，变成可无限生长的连续细胞系或恶性细胞系。因此，培养中的细胞可视为一种在特定的条件下的细胞群体，它们既保持着与体内细胞相同的基本结构和功能，也有一些不同于体内细胞的性状。实际上从细胞一旦被置于体外培养后，这种差异就开始发生了。2、分化：体外培养的细胞分化能力并未完全丧失，只是环境的改变，细胞分化的表现和在体内不同。细胞是否表现分化,关键在于是否存在使细胞分化的条件，如Friend细胞（小鼠红白血病细胞）在一定的因素作用下可以合成血红蛋白，血管内皮细胞在类似基膜物质底物上培养时能长成血管状结构，杂交瘤细胞能产生特异的单克隆抗体，这些均属于细胞分化行为。第二节细胞培养的一般过程一、准备工作准备工作对开展细胞培养异常重要，工作量也较大，应给予足够的重视，推备工作