动物实验的基本技术操作方法

第四章动物实验的基本技术和操作方法南开大学医学院张京玲主要内容动物实验基本技术和操作方法一、动物实验的常用方法二、实验动物的抓取固定方法三、实验动物编号标记方法四、实验动物的随机分组方法五、实验动物被毛的去除方法主要内容六、实验动物给药途径和方法七、实验动物用药量的确定及计算方法八、实验动物的麻醉九、实验动物采血方法十、急性动物实验中常用的手术方法十一、实验动物的急救措施十二、实验动物的处死方法一、动物实验的常用方法动物实验方法是多种多样的，在医学的各个领域内都有其不同的应用，其中一些基本方法都是共同性的，如动物的选择、抓取、固定、麻醉、脱毛、给药、采血、采尿、急救、处死、尸检等，不管是从事何种课题的医学研究都要用这套基本方法，因此，动物实验基本方法，已成为医学科技工作者必须掌握的一项基本功。一、动物实验的常用方法无损伤整体实验整体实验有损伤整体实验动物实验亚细胞实验(按机体水离体实验细胞实验平不同分)组织实验器官实验急性实验（2天以内）动物实验亚急性实验（1～4周）(按实验时慢性实验（2～6个月或更长时间间长短分)甚至整个生命期）一、动物实验的常用方法生理学的动物实验方法病理生理学的动物实验方法动物实验药理学的动物实验方法(按不同病理解剖、组织学动物实验方法学科分)微生物、免疫学的动物实验方法下面举一些动物实验的常用方法：一、动物实验的常用方法1．复制动物模型法此法是动物实验最基本的方法，是采用人工的方法使动物在一定致病因素（机械、化学、生物和物理）作用下，造成动物的组织，器官或全身的一定损伤，复制成与人类疾病相似的动物疾病模型，来研究各种疾病的发生、发展规律及防治方法。一、动物实验的常用方法2．切开、分离法此法是以活体动物为对象的整体实验常用方法。习惯上把在麻醉情况下，制备一些实验条件（如活体解剖、分离暴露器官、组织或进行一些手术制备等措施）进行研究者称“急性动物实验”。其优点是比较简便，操作后可以立即进行观察，实验条件相对地较易控制，对要研究的器官，有可能直接观察。一、动物实验的常用方法3．切除和注入提取液法常用于研究内分泌器官的生理和病理病变，如研究切除某一腺体后看辐射对机体的影响，切除某一腺体后看出现什么症状而推论这种腺体的功能；如蝌蚪无甲状腺素，如注入甲状腺素，蝌蚪很快变成了蛙。一、动物实验的常用方法4．离体组织器官法它是利用动物的离体组织、器官或生物性致病因子（微生物、寄生虫等），置于一定的存活条件下（如温度、营养成分、氧气、水、pH等）进行观察的一种实验方法。一、动物实验的常用方法动物组织、细胞的培养也常用此种方法。离体实验的优点是方法比较简单，一般不需要很复杂的仪器设备。实验条件比较容易控制，牵涉的人力较少，因此常被列为分析性研究的一种手段。不足之处是模拟的存活条件毕竟与整体的实际情况有较大的出入，其结果也往往与体内的变化有一定距离，因此可以作为整体研究的补充和参考。一、动物实验的常用方法5．瘘管法用无菌手术方法给动物造成不同的人造瘘管如胃肠道瘘管、膀胱瘘管、唾液腺瘘管、食道瘘管、胆囊瘘管等。这些瘘管可以收集内脏液体，是生理学消化研究的主要方法。此种方法是慢性动物实验所常用的方法。慢性动物实验一般是先在无菌操作下制备好实验模型（瘘管法是其中一种），待动物恢复健康后进行研究。一、动物实验的常用方法这类研究方法的优点在于被研究的对象，其机体内外环境已处于较自然的相对平衡状态，条件比较稳定，所得的结果接近生理情况。但需要事先制备，术后护理，等动物恢复健康后才能从事实验，花费时间较长，工作量较大，因而在选用上受到一定限制。除了用手术制备的动物实验外，运用药物或食铒等措施制备病理模型，如诱发各种实验性动物疾病模型的方法也可归为慢性动物实验。一、动物实验的常用方法6．移植法一般是将动物的器官、组织或细胞进行相互移植的一种方法。如骨髓移植时，将小鼠A（供体）的骨髓注入到小鼠B的血液中（受体），很快可见脾结节化（脾造血）。脾结节的数量反应了造血干细胞的多少，由此可以观察干细胞的变化。动物各种组织、器官的移植也是实验研究中常用的方法。一、动物实验的常用方法7．生物电、活性观察法对动物体各种生物电用电生理记录仪进行观察记录，如心电、肌电、脑电等；对动物组织中各种活动物质用生物化学法测定，如各种酶，激素等。一、动物实验的常用方法8．病理解剖学、组织学观察法采用肉眼观察、光镜和电镜检查，来观察、分析动物各种疾病时病理组织学改变。可从组织学的角度来探讨疾病防治机理，例如通过阑尾组织切片和肉眼观察，分析口服中药、针刺或局部敷药对有炎症阑尾的影响，阐明不同证型时阑尾变化的病理学特点以及某些病人用中西医结合非手术治疗后复发的原因。一、动物实验的常用方法近年来由于电子显微技术的进展，不仅可以观察到病变时细胞内细胞器等亚细胞结构的变化，而且也可以运用电子扫描方法对动物器官的微小结构进行完整的表层观察。一、动物实验的常用方法9．免疫学观察法注入抗原使动物致敏，制备各种抗血清，如常选用新西兰或大白耳家兔制备病原体免疫血清、间接免疫血清、抗补体抗体血清、抗组织免疫血清等。采用免疫荧光技术、酶标记免疫技术、放射免疫测定技术、免疫电镜技术等对动物免疫后各种免疫变化进行检查。一、动物实验的常用方法10．其它方法如联体动物法，条件反射法、生物遗传法、放射生物法、药物化学法等等。动物实验的基本操作技术方法，根据实验顺序分述如下：二、实验动物的抓取固定方法正确的抓取固定动物，是为了不损害动物健康，不影响观察指标，并防止被动物咬伤，保证实验顺利进行。抓取固定动物的方法依实验内容和动物类而定。二、实验动物的抓取固定方法（一）小鼠抓取固定方法（二）大鼠的抓取固定方法（三）蛙类的抓取固定方法（四）豚鼠的抓取固定方法（五）兔的抓取固定方法（六）狗的抓取固定方法可见实验录像中相关内容。三、实验动物编号标记方法动物在实验前常常需要作适当的分组，那么就要将其标记，使各组加以区别。标记的方法很多，良好的标记方法应满足标号清晰、耐久、简便、适用的要求。常用的标记法有染色、耳缘剪孔、烙印、号牌等方法。三、实验动物编号标记方法（一）颜料涂染这种标记方法在实验室最常使用，也很方便。使用的颜料一般有3-5%苦味酸（黄），2%硝酸银（咖啡色）溶液和0.5%中性品红（红色）等。标记时用毛笔或棉签蘸取上述溶液，在动物体的不同部位涂上斑点，以示不同号码。三、实验动物编号标记方法编号的原则是：先左后右，从上到下。一般把涂在左前腿上的计为1号，左侧腹部计为2号，左后腿为3号，头顶部计为4号，腰背部为5号，尾基部为6号，右前腿为7号，右侧腰部为8号，右后腿计为9号。若动物编号超过10或更大数字时，可使用上述两种不同颜色的溶液，即把一种颜色作为个位数，另一种颜色作为十位数，这种交互使用可编到99号，假使把红的记为十位数，黄色记为个位数，那么右后腿黄斑，头顶红斑，则表示是49号鼠（见图示），其余类推。颜色被毛涂擦标记法三、实验动物编号标记方法（二）烙印法用刺数钳在动物耳上刺上号码，然后用棉签蘸着溶在酒精中的黑墨在刺号上加以涂抹，烙印前最好对烙印部位预先用酒精消毒。三、实验动物编号标记方法（三）号牌法用金属制的牌号固定于实验动物的耳上，大动物可系于颈上。对猴、狗、猫等大动物有时可不做特别标记，只记录它们的外表和毛色即可。四、实验动物的随机分组方法动物实验时，常常需要将选择好的实验动物，按研究需要分成若干个组，分组时为了避免人为的因素影响，常应用随机数字表进行完全随机化的分组。四、实验动物的随机分组方法将实验单位随机分成两组设有小鼠14只，试用随机数字表将其分成两组。先将小鼠依次编为1、2、3……14号，然后任意从随机数字表的某一行某一数字开始抄录14个数，编排如下（见下表），现令单数代表A组，双数代表B组。动物编号1234567891011121314随机数目1622779439495443548217379323归组BBABAABABBAAAA四、实验动物的随机分组方法结果列入A组的动物有8只，列入B组的动物有6只。如要使两组相等，须将A组减少一只，划入B组。应把哪一只小鼠划入B组，仍可用随机数字表，在上述抄录的14个数后面再抄录一个数字为78，此数以8除之，因为归入A组的小鼠有8只，故以8除，得余数6。于是把第6个A（即编写为第12号的小鼠）划给B组。A组3568111314B组124127910经过这样调整，两组小鼠的分配如下：五、实验动物被毛的去除方法动物的被毛常能影响实验操作和结果的观察，因此实验中常需去除或剪短动物的被毛。除毛的方法有剪毛、拔毛和脱毛三种。剪毛固定动物后，用粗剪刀剪去所需部位的被毛。剪毛时需注意以下几点：五、实验动物被毛的去除方法⑴把剪刀贴紧皮肤剪，不可用手提起被毛，以免剪破皮肤；⑵依次剪毛，不要乱剪；⑶剪下的毛集中放在一个容器内，勿遗留在手术野和兔台周围，以保证手术野的清洁和防止注射器等夹毛。五、实验动物被毛的去除方法拔毛：兔耳缘静脉注射或取血时以及给大、小白鼠作尾静脉注射时，需用拇指、食指将局部被毛拔去，以利操作。脱毛：脱毛系指用化学药品脱去动物的被毛，适用于无菌手术野的准备以及观察动物局部皮肤血液循环和病理变化。五、实验动物被毛的去除方法常用脱毛剂的配方：⑴硫化钠3g、肥皂粉1g，淀粉7g，加水适量调成糊状。⑵硫化钠8g、淀粉7g、糖4g、甘油5g、硼砂1g，加水75ml。⑶硫化钠8g，溶于100ml水中。以上脱毛剂配方适用于家兔、大白鼠、小白鼠等小动物的脱毛。⑷硫化钠10g、生石灰15g，溶于100ml水内，此配方适用于狗等大动物的脱毛。五、实验动物被毛的去除方法使用以上各种脱毛剂，都应事先剪短被毛，以节省脱毛剂，并减少对皮肤的刺激反应，应用时用棉球蘸脱毛剂，在所需局部涂一薄层，2-3分钟后，用温水洗去脱落的被毛，以纱布擦干局部，涂一层油脂即可。六、实验动物给药途径和方法给药的途径和方法是多种多样的，可根据实验目的、实验动物种类和药物剂型等情况确定。六、实验动物给药途径和方法（一）皮下注射（二）皮内注射可见皮肤表面鼓起一小皮丘。（三）肌肉注射（四）腹腔注射（五）静脉注射（六）淋巴囊注射皮下注射腹腔注射静脉注射六、实验动物给药途径和方法（七）经口给药（八）其它途径给药1．呼吸道给药2．皮肤给药3．脊髓腔内给药4．小脑延髓池给药5．脑内给药6．直肠内给药7．关节腔内给药小鼠的灌胃给药注射途径小鼠大鼠豚鼠兔狗腹腔0.2-1.01-32-55-105-15肌肉0.1-0.20.2-0.50.2-0.50.5-1.02-5静脉0.2-0.51-21-53-105-15皮下0.1-0.50.5-1.00.5-21-33-10几种动物不同给药途径的常用注射量（毫升）动物名称项目灌胃皮下注射肌肉注射腹腔注射静脉注射小白鼠最大给药量使用针头1ml9(钝头)0.4ml5(1/2)0.4ml5(1/2)1ml5(1/2)0.8ml4大白鼠最大给药量使用针头1ml静脉切开针1ml60.4ml62ml64ml5豚鼠最大给药量使用针头3ml静脉切开针1ml6(1/2)0.5ml6(1/2)4ml75ml5兔最大给药量使用针头20ml10号导尿管2ml6(1/2)2ml6(1/2)5ml710ml6猫最大给药量使用针头20ml10号导尿管20ml72ml75ml710ml6蛙淋巴囊注射最大注射量1ml/只常用实验动物的最大给药量和使用针头规格七、实验动物用药量的确定及计算方法（一）动物给药量的确定在观察一个药物的作用时，应该给动物多大的剂量是实验开始时应确定的一个重要问题。剂量太小，作用不明显，剂量太大，又可能引起动物中毒致死，可以按下述方法确定动物的给药剂量：七、实验动物用药量的确定及计算方法1．先用小鼠粗略地探索中毒剂量或致死剂量，然后用小于中毒量的剂量，或取致死量的若干分之一为应用剂量，一般可取1/10-1/5。七、实验动物用药量的确定及计算方法2．植物药粗制剂的剂量多按生药折算。3．化学药品可参考化学结构相似的已知药物，特别是化学结构和作用都相似的药物的剂量。七、实验动物用药量