时间分辨荧光免疫分析技术

时间分辨荧光免疫分析技术王征达瑞抗体标记免疫学分析技术发展历程免疫荧光分析(Coons,1941)放射免疫分析(Berson和Yalow,1960)酶免ELISA(Engvall,1971)金标免疫分析(Faulk和Taylor,1971)化学发光免疫分析(Arakawa，1977)时间分辨荧光免疫分析(Soini和Hemmila，1979)电化学发光免疫分析(Leland,1990)液相芯片(美国Luminex公司,1997)①免疫荧光②放射免疫④化学发光⑥电化学发光⑤时间分辨荧光③酶联免疫标记免疫技术的理论检测灵敏度放射免疫10-10-10-12mol酶联免疫10-9-10-10mol化学发光10-15mol时间分辨荧光10-18mol电化学发光10-18mol一、时间分辨荧光免疫分析（TRFIA）（Time-resolvedfluorescenceimmunoassay）背景介绍基本原理技术特点反应模式背景介绍1979年，芬兰Wallac公司研发部的Soini和Hemmila首次提出了建立稀土离子标记物的“时间分辨荧光免疫分析”理论1983年，Soini和Kojola首先开发出以镧系元素为示踪物的时间分辨荧光测量仪，建立了新的非放射性微量分析检测技术。同一年，Pettersson等人运用此仪器首次对人绒膜促性腺激素(hCG)进行了时间分辨荧光免疫分析1984年，Hemmila确定了DELFIA(DissociationEnhancedLanthanideFluoroimmunoassay)这种时间分辨免疫分析技术方案,从而使DELFIA成为Wallac的专利技术1988年，加拿大CyberFluor公司的Diamandis创立了一种不同于DELFIA的时间分辨荧光免疫分析，即FIAgen2003年，时间分辨荧光分析技术获国家科技进步二等奖基本原理三价稀土离子包括有铕(Eu)，钐（Sm)，铽(Tb)，镝(Dy)等，它们的荧光光谱具有特异性强﹑Stokes位移大﹑寿命长的特点DELFIA采用异硫氰酸苄基二亚乙基三胺四乙酸铕(DTTA-Eu)为双功能螯合试剂，其一端螯合Eu3+，另一端可与蛋白质的-NH2连接。在中性或接近中性pH条件下，DTTA与Eu3+具有足够的螯合稳定性，而在增强液（呈酸性）作用下，DTTA-Eu又能将螯合的Eu3+迅速、彻底地释放出来并与增强液中的配体螯合﹑进入胶束的疏水内核，使Eu3+荧光得以成千万倍地放大FIAgen采用的是以Eu3+螯合物配基BCPDA为标记物，通过检测其与过量Eu3+形成的螯合物荧光进行定量。由于BCPDA的可检测性不够理想，FIAgen需要利用生物素-亲合素信号放大来弥补BCPDA检测灵敏度的不足DELFIA标记技术碱性时间:(µs）04008001000340nm激发光第二个循环荧光短寿命荧光613nm长寿命荧光延迟时间测值时间通过时间延迟，将特异性荧光与非特异性荧光分辨开来，使理论本底达到0300400500600荧光强度激发光发射光波长(nm)TbDyEuSm500发射光强度2004000600发射光波长(nm)500发射光强度0TRFIA技术特点极长的荧光衰退时间铕：730000nsStokes位移大铕：激发光340nm，发射光613nm狭窄的发射峰解离-增强技术可使其荧光性提高100万倍固相包被抗体铕标记抗体孵育Eu待测抗原++EuEu+增强液+Eu双抗体夹心法示意图双抗原夹心法示意图Eu++孵育+Eu孵育增强液+Eu固相包被抗原待测抗体铕标记抗原中和法示意图(回滴定法)++孵育+Eu孵育EuEu增强液++Eu待测抗体铕标记抗体中和抗原小分子抗原竞争抑制示意图固相包被二抗+孵育++Eu孵育Eu待测抗原铕标抗原Eu增强液++Eu一抗时间分辨技术重点和难点固定相（96孔板）标准品铕标记物二、时间分辨荧光免疫分析（TRFIA）测试仪目前的TRFIA测试仪：国外仪器（Wallac公司PerkinElmer）国内其他公司生产的仪器(上海新波、广州丰华等)达瑞抗体公司自主研发的仪器及软件（DR-M6601）WallacAutoDELFIA1235半自动VICTOR21420半自动ANYTEST2000DR-M6601时间分辨荧光免疫分析仪【粤食药管械（准）字2005第2400226】达瑞公司开发的系列TRF试剂内分泌科检查甲状腺系列：T3、T4、FT3、FT4、TSH、TBG、TG、TGAb、TPoAb糖尿病系列：insulin、C-Peptide生长激素：hGH其他：Cortisol肿瘤科检查AFP、CEA、tPSA、β2-MG、hTG、CA-242、CA-724、CA-50、fPSA、NSE、cyfra211、CA-199、CA-125、CA153传染病检查乙肝系列：HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb其他：HCV、HIV妇产科检查FSH、LH、hCG、Prolactin、Progesterone、SHBG、β-hCG、PAPP-A、Testosterone、uE3、E2血液科检查贫血检查：（Ferritin、VitB12、叶酸）遗传科检查产前筛查：hAFP/Freeβ-hCG新生儿筛查：Neo.hTSH、Neo.T4、Neo.17α-OH-Prog标准品铕标记物Thanks