第七章食品中常见病原菌微生物检验技术

我国卫生部颁布的食品微生物指标有菌落总数、大肠菌群和致病菌三项。致病菌：能够引起人类发病的细菌。对不同的食品和不同的场合，应该选择一定的参考菌群进行检验。一、生物学特性是一大群在血清学上相关的革兰氏阴性杆菌，无芽孢、无荚膜，周身鞭毛，能运动的需氧或兼性厌氧短杆菌。最适生长温度为35℃～37℃，最适pH为7.2～7.4，较抗寒，能耐受较高盐浓度。第一节沙门氏菌检验技术目前至少有67种O抗原和2500个以上血清型,根据其对宿主的致病性,可分为三类伤寒杆菌副伤寒杆菌(甲、乙、丙)人肠热症鼠伤寒杆菌肠炎杆菌猪霍乱杆菌儿童伤寒人、动物急性胃肠炎猪霍乱杆菌、丙型副伤寒杆菌鼠伤寒杆菌、肠炎杆菌败血症沙门氏菌属(Salmonella)二、检验所需器材三、检验程序沙门氏菌检验程序2010四、操作方法分五个步骤：1.前增菌2.选择性增菌3.选择性平板分离4.生化实验5.血清型分型鉴定•国标检测沙门氏菌方法分5个步骤：•1.前增菌：在含有营养的非选择性培养基中增菌，使受损伤的沙门氏菌细胞恢复到稳定的生理状态。•沙门氏菌检测中前增菌的目的是使沙门氏菌恢复其活力。•检测经过加工的食品中的沙门氏菌需要前增菌主要因为加工过程中沙门氏菌受到损伤而处于濒死状态。2.选择性增菌在含选择性抑制剂的培养基中，样品进一步增菌。沙门沙门氏菌检测中增菌的目的是使沙门氏菌以外的细菌（主要是艾希氏菌属）受到抑制，而使沙门氏菌得到一定的增殖，提高沙门氏菌的检出率。3.选择性平板分离划线接种于：BS和XLD琼脂平板或HE琼脂平板各一个，于36+1℃分别培养18—24小时(XLD、HE)或40—48小时(BS)。这一步采用固体选择性培养基，抑制非沙门氏菌的生长，提供肉眼可见的疑似沙门氏菌纯菌落的识别。亚硫酸铋琼脂(BS琼脂)上典型特征木糖赖氨酸脱氧胆盐（XLD）琼脂上典型特征HE琼脂上典型特征4.生物化学试验筛选挑取选择性琼脂平板上的可疑菌落，接种于三糖铁琼脂培养基中。排除大多数非沙门氏菌。也提供了沙门氏菌培养物菌属的初步鉴定。TSI(三糖铁)培养基大肠杆菌和沙门氏菌沙门菌常用生化试验尿素酶试验阴性（黄）阳性（红）靛基质对照管阴性(－)阳性(＋)•P150•（1）A1：典型反应判定为沙门氏菌属。如尿素、氰化钾和赖氨酸脱羧酶3项中有1项异常，按表可判定为沙门氏菌属。如有2项异常，为非沙门氏菌属。（2）A2：补做甘露醇和山梨醇试验，沙门氏菌靛基质阳性变体两项实验结果均为阳性，但需要结合血清学鉴定结果进行判定。（3）A3：补做ONPG。ONPG阴性为沙门氏菌，同时赖氨酸脱羧酶阳性，甲型副伤寒沙门氏菌为赖氨酸脱羧酶阴性。（4）必要时进行沙门氏菌生化群的鉴别。醇发酵试验阳性（黄）阴性邻硝基酚β－半乳糖苷酶试验（ONPG试验）5.血清学分型鉴定提供培养物菌种的鉴定。用分离出的沙门氏菌与已知A-F多价O血清及H因子进行玻片凝集试验。1）抗原的准备2）O抗原的鉴定用A—F多价O血清做玻片凝集试验，以生理盐水做对照。3）H抗原的鉴定4）Vi抗原的鉴定第二节金黄色葡萄球菌检验技术金黄色葡萄球菌近年来，美国疾病控制中心报告，由金黄色葡萄球菌引起的感染占第二位，仅次于大肠杆菌。金黄色葡萄球菌肠毒素是个世界性卫生问题，在美国由金黄色葡萄球菌肠毒素引起的食物中毒占整个细菌性食物中毒的33%，加拿大则更多，占45%，我国每年发生的此类中毒事件也非常多。金黄色葡萄球菌的流行病学金黄色葡萄球葡萄球菌表皮葡萄球菌属分类：腐生葡萄球菌金黄色葡萄球菌食物中毒系毒素型食物中毒。是由于进食含有一种或多种含葡萄球菌肠毒素的食物所引起。常见的菌为金黄色葡萄球菌。一、生物学特性革兰氏阳性需氧或兼性厌氧菌，为球菌，排列成葡萄状，无芽孢、鞭毛，不运动；大多数无荚膜。最适生长温度37℃，最适pH为7.4，对热抵抗力较强，80℃30min才能被杀死。可在10%-15%氯化钠和40%胆汁中生长生物学特性---培养特征大多数菌株产生类胡萝卜素，使细胞团呈现出深橙色到浅黄色，色素的产生取决于生长的条件，而且在单个菌株中可能也有变化可分解葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖，产酸不产气。甲基红反应阳性，VP反应弱阳性。许多菌株可分解精氨酸，水解尿素，还原硝酸盐，液化明胶。具有较强的抵抗力，对磺胺类药物敏感性低，但对青霉素、红霉素等高度敏感。致病性金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常见的病原菌，临床表现多种多样，可引起局部化脓感染，也可引起肺炎、胃肠炎、心包炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染。致病力强弱主要取决于其产生的毒素和侵袭性酶：a.溶血毒素：外毒素，分甲、乙、丙、丁、戊五种，能损伤血小板，破坏溶酶体，引起肌体局部缺血和坏死；b.杀白细胞素：可破坏人的白细胞和巨噬细胞；c.血浆凝固酶：侵入人体时，该酶使血液或血浆中的纤维蛋白沉积于菌体表面或凝固，阻碍吞噬细胞的吞噬作用。葡萄球菌形成的感染易局部化与此酶有关；d.脱氧核糖核酸酶：产生的脱氧核糖核酸酶能耐受高温，可用来作为依据鉴定金黄色葡萄球菌；e.肠毒素：产生数种引起急性胃肠炎的蛋白质性肠毒素，现已鉴定出葡萄球菌肠毒素有A、B、C1～C3、D、E、G、H共9种。肠毒素A是最常见的。金黄色葡萄球菌的致病性葡萄球菌皮肤感染二、检验所需培养基10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤7.5%氯化钠肉汤血琼脂平板Baird-Parker琼脂平板脑心浸出液肉汤(BHI)兔血浆磷酸盐缓冲液营养琼脂小斜面革兰氏染色液无菌生理盐水三、检验程序GB4789.10-2010标准第一法适用于食品中金黄色葡萄球菌的定性检验；第二法适用于金黄色葡萄球菌含量较高的食品中金黄色葡萄球菌的计数；第三法适用于金黄色葡萄球菌含量较低而杂菌含量较高的食品中金黄色葡萄球菌的计数。第一法检样25g样品+225ml7.5%NaCl肉汤或10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤血平板36±1℃24hr镜检营养肉汤血浆凝固酶实验报告结果定性检测36±1℃24hr36±1℃24hr36±1℃6hrBP平板第一法第二法Baird-Parker平板法检验程序定量检测（平板法）适用于检测金黄色葡萄球菌数不小于10/g（mL）的食品25g样品+225ml生理盐水选三个连续梯度，每个梯度各取3mL加入3管胰酪胨大豆肉汤36±1℃45-48hrBP平板血浆凝固酶实验查MPN表定量检测（MPN法）36±1℃45-48h报告结果适用于检测可能含有少量金黄色葡萄球菌，却带有大量竞争菌的样品梯度稀释第三法金黄色葡萄球菌MPN检验程序金黄色葡萄球菌的检测－－测定方法国标方法注意事项•现象观察：染色镜检（形态、染色）•表面光滑的菌落，菌落色素不稳定，但多数为金黄色。Baird-Parker琼脂平板（BP平板）、血平板、血浆凝固酶试验多数产肠毒素的菌株在血琼脂平板上能形成溶血圈，并能产生血浆凝固酶，这些是鉴定致病性金黄色葡萄球菌的重要指标。四、操作方法1.增菌培养法（1）检样处理将25g（mL）检样加于225mL灭菌生理盐水中的灭菌器内，制成1：10检样混悬液。（2）增菌培养吸取液体检样5ml，接种于50mL7．5％氯化钠肉汤50ml进行增菌。（3）分离培养将上述培养物，分别划线接种到Baird-Parker平板和血平板。血平板36℃±1℃培养18h～24h。Baird-Parker平板36℃±1℃培养18h～24h或45h～48h。（4）观察菌落形态Baird-Parker平板、血平板上挑取可疑菌落。金黄色葡萄球菌在Baird-Parker平板上，菌落直径为2mm～3mm，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在其外层有一透明圈。用接种针接触菌落有似奶油至树胶样的硬度，偶然会遇到非脂肪溶解的类似菌落；但无混浊带及透明圈。在血平板上，形成菌落较大，圆形、光滑凸起、湿润、金黄色（有时为白色），菌落周围可见完全透明溶血圈。B-P平板Baird－Parker(BP培养基/贝尔德帕克平板)用于凝固酶阳性葡萄球菌的分离和菌落计数用。￥7（90mm)血平板：金黄色葡萄球菌可以产生溶血素，因此在血平板上产生明显的溶血环。血平板上其典型菌落呈金黄色，有时也为白色，大而突起，圆形，不透明，表面光滑，有溶血圈。血平板（5）革兰氏染色镜检（6）血浆凝固酶试验挑取Baird-Parker平板或血平板上可疑菌落1个或以上，分别接种到5mLBHI和营养琼脂斜面，36℃±1℃培养18h～24h。取新鲜配置兔血浆0.5mL，放入小试管中，再加入BHI培养物0.2mL～0.3mL，振荡摇匀，置36℃±1℃温箱或水浴箱内，每半小时观察一次，观察6h，如呈现凝固（即将试管倾斜或倒置时，呈现凝块）或凝固体积大于原体积的一半，被判定为阳性结果。同时以血浆凝固酶试验阳性和阴性葡萄球菌菌株的肉汤培养物作为对照。也可用商品化的试剂，按说明书操作，进行血浆凝固酶试验。结果如可疑，挑取营养琼脂小斜面的菌落到5mLBHI，36℃±1℃培养18h～48h，重复试验。检测步骤--鉴定金黄色葡萄球菌可以产生凝固酶，因此对其鉴别的主要实验是测定其凝固酶。对于凝固不完全的菌株，可以通过一些其他实验来进一步确认，例如：厌氧葡萄糖发酵、溶葡萄球菌酶敏感性实验、耐热核酸酶实验等。所有这些实验不能作为鉴别其产毒与否的依据。血浆凝固酶试验：吸取1:4新鲜兔血浆0.5mL，放入小试管中，再加入培养24h的金黄色葡萄球菌肉浸液肉汤培养物0.5mL，振荡摇匀，置36±1℃温箱或水浴内，每半小时观察一次，观察6h，如呈现凝块,即将试管倒置或倾斜时，呈现凝块者，被认为阳性结果。同时以已知阳性和阴性葡萄球菌株及肉汤作为对照。【方法】（1）玻片法（2）试管法【结果判断】（1）玻片法：5～10s内出现凝集者为阳性。（2）试管法：如有凝块或整管凝集出现为阳性。4h后无上述现象出现，则放置过夜后再观察。【应用】本试验仅用于致病性葡萄球菌的鉴定。一、动物学试验主要用幼猫和猴。二、血清学试验肠毒素作为抗原，可以和特异性抗体发生结合性反应，产生可见沉淀用血清学反应检验金黄色葡萄球菌肠毒素方法主要有：1.免疫琼脂扩散法2.反向间接血凝试验3.免疫荧光法4.酶联免疫吸附法金黄色葡萄球菌肠毒素的检测对分型进行简单的了解。１、血清学分型：金黄色葡萄球菌水解，获得两种抗原成分：蛋白抗原和多糖抗原。蛋白抗原主要为葡萄球菌A蛋白（SPA)，是一种表面抗原，90%以上金黄色葡萄球菌有此抗原，无特异性。多糖抗原为半抗原，有型特异性。２、噬菌体分型。３、根据肠毒素分型。４、根据血浆凝固酶分型。金黄色葡萄球菌的抗原构造和分型第三节志贺氏菌检验技术志贺氏菌属（shigella）是人类细菌性痢疾最为常见的病原菌，通称痢疾杆菌。通常志贺氏杆菌(Bacillus，shigae)仅指I型痢疾志贺氏菌。志贺氏杆菌是日本志贺诘在1898年首次分离得到的，因此而得名。本属细菌对理化因素的抵抗力较其他肠道杆菌为弱。对酸敏感，在外界环境中的抵抗力能以宋内氏菌最强，福氏菌次之，志贺氏菌最弱。一般56-60℃经10分钟即被杀死。在37℃水中存活20天，在冰块中存活96天，蝇肠内可存活9-10天，对化学消毒剂敏感，1%石碳酸15-30分钟死亡。一、生物学特性1．形态特性本属细菌为两侧平行、末端钝圆的革兰氏阴性杆菌短杆菌。无芽胞，无荚膜，无鞭毛。多数有菌毛。与肠杆菌科各属细菌的主要区别为不运动。2．培养特性1)需氧或兼性厌氧，但厌氧时生长不很旺盛。2)对营养要求不高，在普通琼脂培养基上易于生长。3)在10℃-40℃范围内可生长。最适温度为37℃左右。最适pH值为7.2。4）在固体培养基上，培养18-24小时后，形成圆形、隆起、透明，直径2-3mm、表面光滑、湿润、边缘整齐的菌落。3．生化特性注：＋：阳性；－阴性；－/＋多数阴性，少数阳性；（＋）迟缓阳性；d有不同生化型。福氏志贺氏6型生化特性与A群和C群相似。生化群5％乳糖甘露醇棉子糖甘油靛基质A群：痢疾志贺氏菌－－－（＋）