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分子生物学实验设计方案蛋清溶菌酶的分离纯化·············蛋清溶菌酶的分子量鉴定···········组长：喻芳组员：蒙秋萍安贵杰何玉叶刘飞从蛋清中提取溶菌酶并分离纯化【实验目的】1.掌握离子层析分离纯化溶菌酶的原理以及离子交换层析的操作方法2.理解SDS-聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）测定蛋白质纯度与分子量的原理3.掌握电泳原理以及SDS－PAGE垂直板电泳分离蛋白质技术【实验原理】溶菌酶（lysozyme）是由弗莱明在1922年发现的，它是一种有效的抗菌剂，全称为1,4-β-N-溶菌酶，又称作粘肽N-乙酰基胞壁酰水解酶或胞壁质酶。活性中心为天冬氨酸52和谷氨酸35，是一种糖苷水解酶，能催化水解粘多糖的N-乙酰氨基葡萄糖（NAG）与N-乙酰胞壁酸（NAM）间的β-1，4糖苷键，相对分子质量14700Da，由129氨基酸残基构成，由于其中含有较多碱性氨基酸残基，所以其等电点高达10.8左右，最适温度为50OC，最适PH为6～7左右。在280nm的消光系数[%1cm1A]为13.0。该酶活性可被一些金属离子Cu2+、Fe2+、Zn2+（10-5～10-3M）以及N-乙酰葡萄糖胺所抑制，能被Mg2+、Ca2+（10-5～10-3M）、NaCl所激活。溶菌酶广泛存在于动植物及微生物体内，鸡蛋(含量约为2%～4%)和哺乳动物的乳汁是溶菌酶的主要来源，目前，溶菌酶仍属于紧销的生化物质，广泛应用于医学临床，具有抗感染、消炎、消肿、增强体内免疫反应等多种药理作用。鸡蛋的蛋清中含有丰富的上述物质，本文实验以鸡蛋蛋清为原料，对溶菌酶进行提取并分离纯化。溶菌酶常温下在中性盐溶液中具有较高天然活性，在中性条件下溶菌酶带正电荷，因此在分离制备时，先采用等电点法粗分离，再用DE-52纤维素离子交换色谱和葡聚糖G50凝胶层析分离纯化，最后用SDS-PAGE鉴定。【材料与仪器】鸡蛋3个DE-52纤维素葡聚糖G500.5*7cm色谱柱、2.5*20cm色谱柱、烧杯(100ml,250mL，1000mL)、锥形瓶(100ml)、玻璃棒、漏斗、定性快速滤纸、纱布、量筒（100mL,250mL，1000mL）、10mL离心管、1.5mLEp管、高速离心机、冰箱、SDS-PAGE电泳设备、电炉【试剂配制】1.40%甘油2.冰醋酸3.5mol/LNaOH4.20%磺基水杨酸溶液5.TEMED溶液,4℃保存。6.10%过硫酸铵(AP)：称取过硫酸铵（NH4）2S2O8lg，溶于10mL蒸馏水中。（临用前配制）7.2×SDS上样缓冲液：0.1mol/LTris-Hcl（pH6.8）、4％SDS、20％甘油、0.2％溴酚蓝，4％β－巯基乙醇，4℃保存。8.30%丙烯酰胺贮存液：称取29.2g丙稀酰胺、0.8gN,N’-甲叉双丙稀酰胺，加少量蒸馏水溶解后定容至100mL。过滤，4℃保存。9.分离胶缓冲液（1.5mol/LpH8.8Tris-HCl缓冲液）：取18.2gTris，加少量蒸馏水溶解。用1mol/L盐酸调节pH至8.8（约48ml）后，定容至100mL。10.浓缩胶缓冲液（0.5mol/LpH6.8Tris-HCl缓冲液）：取6.0gTris，加少量蒸馏水溶解。用1mol/L盐酸调节pH至6.8（约48mL）后，定容至100mL。11.4%浓缩胶（10mL）：0.5mol/LpH6.8Tris-HCl2.5mL,胶贮液1.3mL，10%SDS100ul，TEMED10ul，10%AP100ul，双蒸水6.1mL。12.12%分离胶（20mL）：1.5mol/LpH8.8Tris-HCl5mL,胶贮液8mL，10%SDS200ul，TEMED8ul，10%AP200ul，双蒸水6.6mL。13.pH8.3Tris-Gly电泳缓冲液：Tris6g、glycine28.8g、SDS1g，加少量蒸馏水溶解，pH调至8.3，定容至1L。14.考马斯亮蓝染色液：1.25g考马斯亮蓝R250、450mL甲醇：水（1：1）50mL冰醋酸。15.脱色液：450mL甲醇：水（1：1）、50mL冰醋酸。16.0.02mol/LPBS(pH8.0)：取5.3mL0.2MNaH2PO4溶液，94.7mL0.2MNa2HPO4溶液，加蒸馏水稀释至1000mL，混匀【实验步骤】1.溶菌酶的粗提取（约两个半小时）拿3个鸡蛋破壳取蛋清置于250mL烧杯中，轻轻搅拌5分钟，使其的稠度均匀，然后用两层纱布过滤，去除脐带和蛋壳。记录其体积V1加入1.5倍体积的pH8.0PBS缓冲液，搅拌均匀用冰醋酸调pH4.7左右，充分搅拌3500rpm，离心20min弃沉淀，转移上清至烧杯中加入1倍体积的pH8.0PBS缓冲液，搅拌均匀，并用5mol/LNaOH调pH8.0滤纸过滤，取清液，测量并记录体积V2取0.5mL清液并加入等量甘油于1.5mLEp管中，制备2管，-20℃备用余下的清液分装在10mL离心管中-20℃冻存备用。（样品S1）2.溶菌酶的分离纯化（1）DE-52初次纯化溶菌酶①DE-52纤维素的处理a.用0.5mol/LHCl洗涤：称取5克DE-52纤维素置于250ml烧杯中，加入75ml0.5mol/LHCl溶液，搅拌混匀数分钟，静置半小时后，加水100ml，用玻璃棒搅拌，静置10分钟，倾去上层悬浮的细颗粒。重复加水、静置、倾去上层悬浮细颗粒等步骤2~3次，用蒸馏水洗至流出液PH≥4。b.用0.5mol/LNaOH洗涤：加入0.5mol/LNaOH溶液75ml，静置半小时，加蒸馏水100ml，搅拌后倾去上层液，用蒸馏水洗至流出液PH≤8。②装柱色谱柱垂直装好，加入缓冲液赶走柱中气泡；关紧出口，把准备好的DE-52纤维素悬浮液边搅拌边用滴管加入柱内，打开出口，让其沉降，柱床沉体积13cm高，床面盖少量缓冲液，并投入一小圆形滤纸，以隔开凝胶床面，再用缓冲液平衡。③加样、洗脱当柱床尚残留缓冲液约1~2mm时，加入样品S115滴左右，当样品全部进入柱床后，先吸取磷酸盐缓冲液约3~4滴冲洗，然后再加入缓冲液冲洗，用20%磺基水杨酸检测流出液有无蛋白质，用1.5mL管收集4~5滴蛋白质溶液。（收集完后，紧接着用20%磺基水杨酸检测之后的液体中有无蛋白质）。（样品S2）（2）葡聚糖G50再次纯化溶菌酶①凝胶的处理商品凝胶是干燥的颗粒，使用前需在水中溶胀，溶胀必须彻底，否则会影响色谱的均一性。故在实验前先称取5克葡聚糖G50于烧杯中加入5~10倍水，让其自然溶胀24小时以上，经这样处理的凝胶才能准备装柱。②装柱用0.02mol/LpH8.0PBS溶液将凝胶调成稀薄的浆状液，盛于烧杯中，然后在轻微地搅拌下使凝胶缓慢地沉降于柱内，松开流出口夹子，让其自然沉降，凝胶加至沉体积约占柱长的2/3为止，盖上一小圆形滤纸，以防加样时冲散凝胶表面，夹住流出口的橡皮管。③加样、洗脱当柱床顶部的0.02mol/LpH8.0PBS溶液（洗脱液）尚残留少许时，缓慢加入样品S2，松开流出口夹子，当样品全部进入柱后，可先加入少量洗脱液冲洗粘附在柱壁上的样品，然后再加洗脱液洗脱，用20%磺基水杨酸检测流出液中有无蛋白质，以及时收集含蛋白质的洗出液。3.溶菌酶纯度鉴定与分子量测定(1)蛋白样品的处理取200µL上述备用蛋白样品于带塞的小离心管中，加入200µL的2×上样缓冲液，混匀，轻轻盖上盖子，封口膜封紧瓶口以免加热时迸出，在100℃沸水浴中加热3～5min，取出后10000r/min离心10min，取上清待用。①电泳玻璃板洗净，并把玻璃板在灌胶支架上固定好。(试样格（梳子）临用前用无水乙醇擦拭，让其挥发至干。)②按比例配好分离胶，用移液管快速加入，大约5cm左右，之后加少许蒸馏水，静置30分钟。（凝胶配制过程要迅速,催化剂TEMED要在注胶前再加入,否则凝结无法注胶.注胶过程最好一次性完成,避免产生气泡。水封的目的是为了使分离胶上延平直，并排除气泡。凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面。）③倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干，按比例配好浓缩胶,连续平稳加入浓缩胶至离边缘5mm处，迅速插入样梳，静置。（样梳需一次平稳插入,梳口处不得有气泡,梳底需水平。）④拔出样梳后，在上槽内加入缓冲液，没过锯齿时可拆去底端的琼脂糖。（要使锯齿孔内的气泡全部排出,否则会影响加样效果.）⑤加样，从第一个开始按已编排好的顺序依次加入蛋白Marker和相应体积的样品。其中Marker和样品加样量均为20µL。（微量移液器不可过低,以防刺破胶体,也不可过高,在样下沉时会发生扩散。为避免边缘效应，最好选用中部的孔注样。）⑥电泳槽中加入缓冲液，接通电源，进行电泳，开始电流恒定在20mA，当进入分离胶后改为30mA，溴酚蓝距凝胶边缘约5mm时，停止电泳。⑦凝胶板剥离与染色：电泳结束后，用专用工具撬开短玻璃板，从凝胶板上切下一角作为加样标记，然后放在大培养皿内，加入染色液，42℃染色40min左右。（剥胶时要小心,保持胶完好无损,染色要充分。）⑧脱色：染色后的凝胶板用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，直到蛋白质区带清晰。⑨将凝胶扫描分析，求出溶菌酶的相对分子质量。【注意事项】1.等电点沉淀后利用离心的办法，要尽量除去沉淀；2.调节pH时要避免局部过酸；3.提取过程中尽量避免泡沫的产生4．加样蛋白浓度低于20mg/mL，上样体积小于柱体积的1/3。5.在整个实验过程中，流速必须得到一定的控制。过大，会使填料压缩紧密，导致流速过低，层析柱有可能堵塞而实验失败，流速过小，实验时间过长，引起酶的活性变化。对于CMSepharoseFF填料，最适流速在100cm/h以下。因此，在我们的实验中，控制流速为2mL/min。6．冲平过程一定不能省。因为在上样过程中，还有未挂柱的蛋白未能从色谱柱中完全流出，因此需先用缓冲液对整个色谱柱进行冲平，以便使未结合或结合不紧密的杂蛋白流出，以免干扰洗脱。7．N,N’-亚甲双丙烯酰胺为神经毒性物质，可经皮肤直接吸收，使用时应避免其直接接触皮肤，必要时应戴手套。但其凝固后就变成无毒物质。8．安装电泳槽时要注意均匀用力旋紧固定螺丝，避免缓冲液渗漏。9．用琼脂(糖)封底及灌胶时不能有气泡，以免电泳时影响电流的通过。10．加样时样品不能超出凹形样品槽。加样槽中不能有气泡，如有气泡，可用注射器针头挑除。【参考文献】[1]李蓉,陈国亮.高效阳离子交换色谱法分离纯化蛋清中的溶菌酶.色谱,2002,20(3):259-261.[2]张文会,王艳辉,马润宇.离子交换法提取鸡蛋清溶菌酶.食品工业科技,2003,23(6):57-59.[3]J.萨姆布鲁克等著.黄培堂等译.2002。分子克隆实验指南.第3版.北京：科学出版社[4]张维铭主编.2003.现代分子生物学实验手册.第1版.北京:科学出版社[5]林亲录，马美湖，金阳海，秦丹，胡亚平.鸡蛋卵清中溶菌酶的提取与纯化