荧光显微成像系统的原理及构成

荧光显微成像系统的原理及构成原理●普通光学显微镜通过普通光源的照明观察标本●荧光显微镜利用一定波长的光，激发显微镜下标本内的荧光物质，使之发射荧光什么是荧光？●物质吸收的短波光，发射出的长波光●特点：荧光波长激发光波长荧光强度激发光强度有不同程度的衰减荧光显微镜的特点●光源能供给大量特定波长范围的激发光，使受检标本内的荧光物质能获得必要强度的激发光●具备相应的滤光镜系统。荧光显微镜的种类●透射式●落射式目镜吸收滤色镜物镜暗场聚光镜激发滤色镜汞灯透射荧光显微镜原理图标本汞灯激发滤色镜分色镜吸收滤色镜物镜标本落射荧光显微镜原理图透射式●汞灯光源●激发滤色镜●暗场聚光镜●吸收滤色镜落射式●汞灯光源●激发滤色镜●分色镜●吸收滤色镜荧光显微镜的主要部件各部件介绍●光源多采用200W的超高压汞灯作光源提供激发光（紫外和蓝紫光）●滤色系统激发滤色镜：选择激发光的波长吸收滤色镜：透过荧光，阻挡杂光（完全阻挡激发光通过）＞B透过＜B阻挡T%T%nm●分色镜反射激发光，透过荧光●暗场聚光镜来自下面光源的光线经过暗场聚光镜，形成了横过显微镜视野而不进入物镜的强烈光束。因此视野是暗的＞A透过＜A反射T%●物镜各种物镜均可应用，但最好使用消色差的物镜提高荧光图像的亮度，应使用镜口率大的物镜●目镜在荧光显微镜中多用低倍目镜，如5×和6.3×荧光图像的记录方法荧光显微镜所看到的荧光图像具有：形态学特征和荧光的颜色、亮度判断结果时，必须将二者结合起来综合判断记录结果：主观指标（即工作者目力观察）客观指标（细胞分光光度计、图像分析仪等）荧光显微摄影技术●由于荧光很易减弱褪色，要及时摄影记录结果，所以荧光显微镜摄影技术对于记录荧光图像十分必要。●因紫外光对荧光猝灭作用大，所以曝光速速度太慢，就不能将荧光图像拍摄下来。●一般研究型荧光显微镜都有半自动或全自动显微镜摄影系统装置，或用CCD与计算机连接，将图像存在计算机硬盘上。CCD主要功能：•光信号转电信号•电信号转成数字信号•配合计算机形成影像CCD概念●CCDChargedCoupledDevice:电荷耦合元件大量的独立的光敏元件排列在一起每个光敏元件称为像素●像素图像的基本单位：最小的视觉显示单位.CCD结构及工作原理●CCD结构•感光二极管（Photodiode）•并行信号寄存器（ShiftRegister）-用于暂时储存感光后产生的电荷•串行信号寄存器（TransferRegister）-用于暂时储存并行寄存器的模拟信号并将电荷转移放大•信号放大器-用于放大微弱电信号•数摸转换器-将放大的电信号转换成数字信号隔行传输式（InterlineTransfer）-感光元件产生电信号-电荷转移到并行寄存器-电荷从并行寄存器转移到串行寄存器-串行寄存器将电信号转到模拟寄存器-放大、数摸转换、数字信息快速-暴光和数据读出可同时进行可采用软件控制的电子快门工作动态范围小CCD种类-传输方式全帧（FullFrame）-感光元件产生电信号-电荷转移到串行寄存器-放大、数摸转换、数字信息动态范围宽信噪比高分辨率高成像速度慢必须借助机械快门控制暴光量CCD种类-传输方式全转（FullFransfer）-综合FullFrame和InterlineTransfer特点，在器件上划分感光区和寄存区-暴光和数据转移可以同时进行保证单位像素上的感光面积保证了拍摄速度CCD种类-传输方式CCD种类-扫描方式●面阵或面扫描（AreaArrays）：可以在一次曝光中以任意快门速度捕捉动体，创建二维的影像主要应用在高阶数码相机、监视器和摄录像机等CCD种类-扫描方式●线阵或线扫描（LinearArrays）：排成一排的像素构成，逐行扫描成像（获取彩色图像时，为了分别得到RGB三基色的信息，需要扫描三次，每次对应一种颜色）适合获取静态图像，分辨率高CCD种类-扫描方式●三线（Tri-LinearSensor）：排成三排的像素构成，每一排对应一种基色（RGB）不用扫描三次，且能得到很高的分辨率和色域CCD与显微镜的连接物镜激发滤色片生物标本分色镜吸收滤色片激发光源谢谢