遗传论文

DNA甲基化作用的生物学功能陈舒文09070143生科院07级1班摘要:DNA甲基化作为DNA序列的修饰方式,是一种重要的表观遗传机制,能够在不改变DNA分子一级结构的情况下调节基因组的功能,在生命活动中起着重要的作用。其功能主要可归结为以下4个方面:维持基因组遗传物质的稳定性,调控基因的表达,建立表观遗传模式以及参与细胞及胚胎的形态建成。关键词:DNA甲基化;DNA甲基转移酶;表观遗传;印迹基因;X-染色体失活DNA甲基化作用(DNAmethylation)是在DNA甲基转移酶(DNAmethyltransferase,Dnmt)的催化下,以S-腺苷甲硫氨酸(S2adenosyl2methi2onine,SAM)为甲基供体,将甲基(-CH3)转移到DNA分子中特定碱基上的过程,最常见的是在胞嘧啶上形成5′甲基胞嘧啶[1]。DNA甲基化作为DNA序列的修饰方式,是一种重要的表观遗传机制,能够在不改变DNA分子一级结构的情况下调节基因组的功能,在生命活动中起着重要的作用。诸如:保持基因组遗传物质的稳定性;调控基因的表达;建立表观遗传模式以及参与细胞及胚胎的形态建成等。在植中,DNA甲基化主要参与植物基因表达的调控,进而调节植物的生长发育。DNA甲基化在植物开花、植物花器官形成的调控以及植株转基因过程中的基因沉默中都发挥作用。植物体可以通过甲基化、去甲基化和从头甲基化来控制基因的表达,使基因可在自身需要时表达,不需要时关闭表达,这样植物就能在不同的环境条件、不同的发育阶段调控基因的时空表达。1DNA甲基化模式与DNA甲基化相关的酶1.1DNA甲基化模式DNA甲基化的主要形式有5-甲基胞嘧啶、N6-甲基腺嘌呤和N4-甲基腺嘌呤[1]原核生物可对胞嘧啶与腺嘌呤甲基化,而真核生物中甲基化仅发生于胞嘧啶。在哺乳动物基因组中,DNA甲基化的主要位点是CpG二核苷酸位点,它在基因组中呈不均匀分布。启动子区的CpG岛通常处于非甲基化状态,基因能正常表达;当其发生甲基化时,会影响基因的转录调控,使基因表达发生沉默。当肿瘤发生时,抑癌基因CpG岛以外的CpG位点的非甲基化程度增加,而CpG岛中的CpG位点则呈高度甲基化状态,造成染色体的结构改变从而使抑癌基因沉[2]。在高等植物中还存在另外两种DNA甲基化位点,即CpNpG位点与CpNpM非对称位点,主要通过植物所特有的一类甲基化转移酶CMT进行维持[3]。1.2DNA甲基化转移酶目前,在大肠杆菌中发现了两种与甲基化形成相关的酶,即使腺嘌呤甲基化的脱氧腺苷甲基化酶(Dam)和使胞嘧啶甲基化的脱氧胞苷甲基化酶(Dcm),两者都是以S-腺苷甲硫氨酸为甲基供体,主要与寄主所控制的限制与修饰相关。在不同真核生物中甲基转移酶的分布各不相同[3]。有的生物如秀丽线虫(Caenorchabditisele2gans)与酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的基因组中检测不到甲基化的存在,甚至没有甲基化转移酶的编码序列;但是有的生物如拟南芥中就存在至少十种甲基转移酶的基因。根据甲基转移酶C-端催化结构域的保守性,可以把DNA甲基转移酶分为4个不同的家族[3]:DNA甲基转移酶1(DNAmethyltransferase21,Dnmt1)家族,Dnmt3家族,Dnmt2家族及CMT(chromomethylase)家族[2]。Dnmt1是真核生物中发现的第一个甲基转移酶,为组成型DNA甲基转移酶。它与DNA的复制直接相关,可以对半甲基化的新生子链进行甲基化,从而在细胞分裂中维持甲基化模式在亲子代中的传递。Dnmt1也具有一定的从头甲基化的能力,其变体Dnmt1o能够参与甲基化模式的建立与印迹基因的等位特异表达等。此外,Dnmt1也具有依赖于DNA复制的去甲基化的功能[4]。Dnmt1家族在植物中特称为MET家族。Dnmt3家族包括Dnmt3a与Dnmt3b,为组织特异性的DNA甲基转移酶,在胚胎干细胞和早期胚胎中高度表达,参与DNA甲基化的从头合成所建立新的甲基化模式。Dnmt3a与Dnmt3b所介导的甲基化目标位点是不同的,后者能够特异地对着丝粒卫星重复序列进行从头甲基化。此外,Dnmt3也可能是胚胎发育中主动去甲基化的执行者[4]。Dnmt3L缺乏甲基转移酶活性,可能主要是协助Dnmt3a与Dnmt3b完成卵母细胞甲基化的建立。Dnmt3家族在植物中特称为DRM家族。Dnmt2家族也具有胞嘧啶甲基转移酶的活性。Goll等[5]发现从人类与黑腹果蝇中纯化得到的Dnmt2也可以使tRNA的胞嘧啶甲基化,Dnmt2的具体功能仍在研究中。CMT家族是植物中所特有的一类甲基转移酶,主要负责维持CpNpG与CpNpM(M是A、T或C)三核苷酸中胞嘧啶的甲基化。Cao等[6]在对拟南芥drm和cnu3突变体的研究中发现,CpNpG与CpNpM三核苷酸序列中胞嘧啶甲基化的维持都依赖于CMT3的存在,drm突变体中CpNpN(N非G)核苷酸序列中胞嘧啶的甲基化几乎丧失了大部分,CpNpG核苷酸序列中胞嘧啶的甲基化则部分损失,说明DRM和CMT3共同作用以维持植物所特有的非CpG核苷酸序列中胞嘧啶的甲基化。2DNA甲基化与遗传物质的稳定性在生物个体的生长发育与繁殖过程中,维持遗传物质的稳定性是至关重要的。细胞采用多种机制来保证DNA复制的忠实性,如DNA的双螺旋结构与半保留复制模式为遗传物质的稳定提供了物质基础;DNA聚合酶Ⅲ除了具有DNA聚合酶活性外还具有5′到3′的核酸外切酶活性,可及时去除错配掺入的碱基;DNA复制后存在多种修复机制进一步保证了遗传物质的稳定性。DNA甲基化在DNA复制起始、错配修复、细菌中寄主控制的修饰与限制以及转座子的失活等过程中对维持遗传信息的稳定性发挥着重要的作用。2.1DNA甲基化与DNA复制起始研究证明,细菌中DNA复制起始与DNA甲基化以及DNA与细菌质膜的相互作用相关。大肠杆菌的oriC位点中共有11个四碱基回文序列GATC,Dam甲基化酶可以使该序列中的腺嘌呤第6位N上甲基化。当DNA起始复制后,oriC位点的亲代链保持甲基化修饰,而新合成链上没有甲基化修饰,大约经过13min后才会被甲基化,处于半甲基化状态的起点不能再发生复制起始。但基因组中其余部位的GATC在复制后通常很快就可被甲基化。实验证明,半甲基化的oriC位点可与细胞膜相互结合,但全甲基化的就无法与细胞膜结合。由此推测,oriC位点与膜的结合阻碍了Dam对其GATC位点的甲基化作用从而使oriC位点处于无活性的状态。oriC位点与细胞膜的结合使复制的DNA随细胞膜的生长而被移向细胞的两部分,只有当此过程完成后,DNA复制起点才能从膜上脱落下来并被甲基化而起始新一轮的复制。DNA半甲基化作为一种标签决定了复制起点与细胞膜的结合,控制了复制起始,使得DNA复制与细胞分裂保持一致。2.2DNA甲基化与错配修复DNA错配修复(mismatchrepair)作为细胞增殖过程中纠正DNA复制错误的重要手段[7],对保证DNA复制的忠实性与基因组的稳定性起重要作用。目前,已经发现6种基因成分,即MLH1、MSH2、MSH3、PMS1、PMS2与MSH6/GTBP,其中以MLH1与MSH2最为重要。若DNA在复制过程中发生错配,如果新合成链上错误掺入的碱基被校正,基因编码信息便可得到修复。由于复制时旧链上的5′2GATC23′是甲基化的,而新链上的5′2GATC23′是非甲基化的,在合成后2～5min才会被Dam甲基化酶甲基化。因此复制后双链DNA在短期内(数分钟)保持半甲基化状态,错配修复系统从而能够区分“旧链”与“新链”,为校正新链中掺入的错误碱基提供了理想的分子标记,特称为半甲基化标记[8]。2.3DNA甲基化与细菌中的限制修饰系统细菌的限制修饰系统同高等生物中的免疫体系相类似,是能够辨识自身DNA与外来DNA并使后者降解的保护体系,是由甲基转移酶与核酸内切限制酶配合完成的。核酸内切限制酶能够识别DNA分子上特定的碱基序列即限制位点,并在此切割DNA分子的双链,外源DNA因此被降解成相当短的片段。而甲基转移酶(甲基化酶)能够催化甲基(-CH3)从甲基供体SAM上转移到限制识别序列的特定碱基上,使之发生甲基化修饰作用。细胞自身的DNA由于受到这种甲基化修饰作用,因此不会被自身的核酸限制内切酶切割消化。寄主控制的限制与修饰系统保护了自身DNA不被降解而使外源DNA迅速降解,从而保证了自身基因组的稳定性。2.4DNA甲基化与转座子失活最早由McClintock发现在玉米中转座子存在有活性与失活的循环变化,后来证明这与DNA的甲基化相关[9]。后来在哺乳动物的基因组中发现与转座作用相关的序列[10],都呈高度甲基化的转录沉默状态。在人类基因组中,35%的序列为散乱的内源性转座子DNA。有的转座子如L1重复元件等能够编码一些转录所必须的调控因子,其转座作用或表达有可能破坏正常基因的功能或引起染色体重排等。因此对这些序列的高度甲基化就可以抑制活性,从而维持基因组的稳定性并保证正常基因的表达。植物中的转座子和反转座子由重复序列组成,呈高度特异的甲基化状态[9]。植物转座子甲基化的丢失会激活转座子,使其发生移动例如,在拟南芥甲基化缺失突变体中,沉默的转座子可以重新被激活。3DNA甲基化与基因表达调控在真核生物基因组中,基因仅仅占一小部分,例如在人类基因组中基因的编码序列还不到2%,那么在大量非编码DNA存在的情况下,实现精确控制基因的表达,降低周围的转录噪音对生物体至关重要。DNA甲基化作为一种可遗传的修饰方式为非编码DNA(内含子、重复元件以及潜在的具有活性的转座子)的长期沉默提供了一种有效的抑制机制[10]。DNA复制后胞嘧啶的甲基化会改变DNA的构象,使DNA的大沟无法与DNA结合蛋白正常结合,从而使这些非编码区长期保持无表达活性的状态。而有转录活性的基因可利用非甲基化的启动子来进行转录表达,即使在相邻的非转录区是高度甲基化的,其启动子仍然可以起始转录并被调控。基因启动子区内CpG位点的甲基化可能通过3种方式影响该基因转录活性[11]:①DNA序列甲基化直接阻碍转录因子的结合;②甲基CpG结合蛋白(methyl2CpG2bindingproteins,MBPs)结合到甲基化CpG位点,与其他转录复合抑制因子相互作用或招募组蛋白修饰酶改变染色质结构;③染色质结构的凝集阻碍转录因子与其调控序列的结合。3.1甲基化DNA直接抑制转录因子的结合DNA甲基化会改变DNA分子的空间构像,甲基伸入到DNA双螺旋的大沟,直接干扰特异转录因子与相应的识别位点结合。有的转录因子[12]如AP22、CTCF、C2Myc/Myn、CAREB、E2F2和NF2κB等,能识别含有CpG岛的序列并对DNA甲基化十分敏感。CpG位点胞嘧啶的甲基化将抑制转录因子与顺式作用元件之间的结合,从而阻碍相关基因的转录。而另一些转录因子(如SP1和CTF)对结合位点中的甲基化并不敏感,还有许多转录因子在DNA上的结合位点上不含CpG二核苷酸,使DNA甲基化对这些转录因子基本无抑制作用,因此这种机制并不具有普遍性。3.2甲基CpG结合蛋白与转录抑制人们直到发现了一类含有甲基化CpG结合结构域的蛋白家族(MBPs)才从分子机制上将CpG位点甲基化与转录抑制联系起来。MBPs能特异性结合甲基化CpG位点。MBPs包括MBD(methyl2CpG2bindingdomain)家族,MBD家族[11]包括MBD1、MBD2、MBD3与MBD4。MBD1除含有MBD区域外还有3个锌指结合区域(CXXC)和1个C端转录抑制区域(TRD)。MBD2含有甲基化CpG结合域MBD和与之重叠的TRD区域,其N端含有GR重复序列。MBD4有1个MBD区域,其C端糖苷酶区域与DNA修复有关。MBDs往往以蛋白复合体的形式发挥作用[12]。甲基化CpG结合蛋白复合体1(methyl2CpG2bindingcomplex1,MeCP1)能够识别并结合到甲基化CpG岛的DNA序列上,但结