In-Cell-Western-Protocol

Odyssey近红外双色激光成像系统In-CellWesternProtocolEGF对A431细胞刺激效应的评估（中文版）基因有限公司2007年1月In-CellWesternProtocol-1-目录Ⅰ.需要的试剂..........................................................................................................................-1-Ⅱ.养细胞、刺激和检测A431细胞对EGF的反应..............................................................-1-Ⅲ.实验注意事项......................................................................................................................-4-Ⅳ.实验结果..............................................................................................................................-5-Ⅰ.需要的试剂Odyssey试剂zIRDye800CW标记的山羊抗小鼠的二抗（LI-CORCat.#926-32210）*zIRDye680标记的山羊抗兔二抗（LI-CORCat.#926-32221）**LI-COR和Rockland也有其他类型IRDye800CW标记的二抗；Invitrogen也有其他类型AlexaFluor680二抗zOdyssey封阻液（LI-CORCat.#927-40000）其他试剂z1×PBS洗脱液z细胞培养试剂（血清，DMEM，胰岛素，1×PBS）z20%Tween-20zEGF（表皮生长因子）（UpstateCat.#01-107）z37%甲醛z10%TritonX-100zNunc96孔板（NuncCat.#167008）z下述的一抗特别注意：磷酸化EGFR和磷酸化ERK分别从CST和SantaCruz购买。血清饥饿细胞要达到最大的反应。Ⅱ.养细胞、刺激和检测A431细胞对EGF的反应1.按照标准的细胞培养步骤，在DMEM和10%小牛血清（FCS；Gibco）的长颈瓶中培养A431细胞，直到达到80-90%的细胞覆盖度（confluency）（约1.5×107个细胞）2.去除培养基、灭菌的1×PBS洗细胞，然后再用胰岛素酶化细胞3.离心法转移细胞培养基和细胞小球4.轻轻敲打管壁，去除上清和悬浮的细胞球。避免用移液器大力吸打或用Voetex震荡，以保证细胞的完整性5.用全培养基稀释细胞至20ml，并用血球计计数6.用全培养基稀释细胞至200,000细胞/mlIn-CellWesternProtocol-2-7.轻轻的充分混合细胞悬浮页8.灭菌条件下，向96孔板每孔分装200µl细胞悬浮液（40,000细胞/孔）9.孵育细胞并监测细胞密度，直到每个孔内细胞都汇合，这个过程大约需要3天10.加热不含血清的培养基（D-MEM；Gibco）到37℃11.用真空器抽气去除微孔板内的全培养基12.向每个孔内更换200µl不含血清、预热的培养基，孵育4-6h13.在另一个96孔板的每个孔内分装100µlD-MEM14.第一和第二个孔不加EGF（休眠细胞对照）。其余的孔内加入EGF，浓度按倍比梯度从0.2-100ng/ml。实验设计见图1。15.抽气法去除每个孔内的饥饿培养基16.将分装微孔板内的EGF稀释溶液转移到含有细胞的微孔板内17.37℃孵育7.5min18.准备新鲜的固定缓冲液：1×PBS45.0ml37%甲醛5.0ml3.7%甲醛50.0ml19.抽气法去除含有EGF的培养基，迅速加入150µl的新鲜固定缓冲液固定细胞，免摇动在室温条件下孵育20min。加固定缓冲液时，小心地用移液器沿管壁加入，避免使细胞分离20.准备Triton洗脱缓冲液：1×PBS495ml10%TritonX-1005ml1×PBS+10%TritonX-100500ml21.抽气法去除固定缓冲液22.用Triton洗脱缓冲液分4次洗脱细胞，每次200µl5min，以保证可以渗透细胞注意：z每次洗脱可在摇床上进行，室温条件下5minz洗脱过程中，切勿让孔/细胞变干，每次操作之后快速加入洗脱液23.抽气法去除Triton洗脱缓冲液24.每个孔内，小心地从管壁加入150µlLI-COROdyssey封阻液（#927-40000），在摇床上缓慢摇动室温下孵育1.5h。注意：z一种封阻液不是对每对抗原-抗体的效果都理想的，某些一抗在不同的封阻液中可能会出现信号大幅度降低或表现非特异性条带。如果目标蛋白不能被检测，尝试更换一种封阻液可能会大大改善实验结果。如果以前化学发光所用的封阻液和一抗效果不错，那么在In-CellWestern中继续使用这个抗体和封阻液zOdyssey封阻液于其他封阻液相比，具有更高的灵敏度和高稳定的表现。脱脂奶粉或干酪素溶于PBS也可用于封阻和稀释抗体。如果使用抗羊的的抗体，则脱脂奶粉封阻液会有干扰，而且即使4℃条件下很容易腐败，所以难以长期保存，且只能在数天之内重复使用。如果使用干酪素，推荐在0.2×PBS缓冲液里浓度为0.1%z也可使用含有BSA的封阻液，但某些情况下会造成背景过高，所以通常不推荐使用这类封阻液，除非一抗特别要求封阻液含有BSAIn-CellWesternProtocol-3-25.在LI-COROdyssey封阻液中稀释抗体要注意如下提示：一抗可以按照不同组合加入，通常一种抗体可以抗磷酸化目标蛋白，另一种抗体是抗目标蛋白（无论磷酸化状态如何）。下列建议的一抗组合取决于被检测的目标蛋白：a.Phospho-EGFRTyr1045（兔，1:100稀释，CST2237）TotalEGFR（小鼠，1:500稀释，BiosourceInternationalAHR5062）b.Phospho-EGFRTyr1045（兔，1:100稀释，CST2237）TotalERK2（小鼠;1:75稀释，SantaCruzBiotechnologySC-1647）c.Phospho-ERK（小鼠，1:100稀释，SantaCruzBiotechnologySC-7383）TotalERK1（兔，1:200稀释，SantaCruzBiotechnologySC-94)d.Phospho-EGFRTyr1045（兔，1:100稀释，CellSignalingTechnology2237)Phospho-ERK(小鼠，1:100稀释，SantaCruzBiotechnologySC-7383)26.在一批微孔内分别加入50µl的LI-COROdyssey封阻液，作为由于近红外染料标记的二抗可能产生背景的对照。实验设计见图1的例子27.在加入微孔前充分混合两种一抗溶液28.抽吸其他微孔内的封阻液并加入50µl已混合好的一抗，一抗溶液应该覆盖管底29.室温条件下缓慢摇动，孵育一抗2h注意：a.为达到最高的灵敏度，4℃不摇动孵育过夜b.为防止细胞干燥，过夜孵育时需盖住微孔板30.准备Tween洗脱液：1×PBS995ml20%Tween-205ml1×PBS+0.1%Tween-201000ml31.从管壁缓慢加入Tween洗脱液，以免使细胞分离。使用足量的洗脱液（200-500µl），在室温条件下缓慢摇动，洗脱5min32.重复洗脱步骤4次以上33.计算试验的二抗用量，在Odyssey缓冲溶液中稀释荧光标记的二抗注意如下提示。为了降低背景，加入Tween-20最终浓度为0.2%a.Goatanti-rabbitIRDye™680(1:200dilution;LI-CORCat#926-32221)b.Goatanti-mouseIRDye™800CW(1:800dilution;LI-CORCat#926-32210)建议稀释浓度范围：1:200-1:1,200避免抗体试剂瓶长时间暴露在光线下34.充分混合抗体溶液，每个孔内加入50µl二抗溶液，室温下避光缓慢摇动，孵育60min35.沿管壁加入Tween洗脱液（第30步），避免使细胞分离。使用足量的洗脱液（200-500µl），在室温条件下缓慢摇动，洗脱5min避光操作36.重复洗脱步骤4次以上In-CellWesternProtocol-4-37.洗脱结束之后，从孔内完全去除洗脱液。翻转微孔板底部朝上，在纸巾轻轻敲打，去除残留的洗脱液。为了得到更好的效果，应立即扫描微孔板，当然也可以在4℃避光保存数周38.扫描前，用无屑湿纸清洁扫描面板和微孔板底部39.用700nm和800nm两个通道同时扫描，均选择中等质量、169µm的分辨率、3.0mm的焦距、亮度为5Ⅲ.实验注意事项微孔板的选择会显著影响实验结果，因为每种微孔板有各自的特性，包括孔深、孔板自身荧光和管与管之间的信号交叉。对于微孔板的选择请注意如下的事项：z微孔内的In-CellWestern检测无液体存在，为避免结果出现管与管之间交叉信号，可使用黑管壁透明管底的微孔板。切勿使用白色管子的微孔板，因为白色管壁表面的自身荧光会产生显著的噪音信号。zIn-CellWestern要求使用灭菌微孔板做细胞培养，推荐使用如下的微孔板：96wellformatNunc™(PartNumber161093,165305)96wellformatFalcon™(PartNumber353075,353948)384wellformatNunc™(PartNumber164688,164730)384wellformatFalcon™(PartNumber353961,353962)zOdyssey对微孔板要求从扫描面板到微孔板的目标检测区域最大距离不超过4.00mm。如果使用上述推荐的微孔板，扫描时焦距为3.0mmz如果使用其它微孔板，则可能需要调高或调低焦距以优化分辨效果和检测效果。优化是必须的，先用0.5、1.0、2.0、3.0和4.0分别扫描孔板内的试验样本和对照，选择结果信噪比最高的焦距作为扫描参数z为了达到最高灵敏度，扫描前孔板避光保存。如果扫描后需要保存孔板，则需在室温条件下或4℃避光保存z首次扫描可将700和800通道的亮度都设为5，如果扫描结果饱和或太亮，则再扫描时使用较低的亮度（如：2.5）。如果信号太弱，则调高亮度值（如：7.5）z扫描质量可选择中等到最低，扫描分辨率推荐为169µm，可在最短的时间内达到满意的结果。如果使用较高的扫描质量或分辨率，则需要更长的扫描时间z为了验证一抗的特异性，可像在孔板内一样做细胞裂解物的WesternBlot，在Odyssey上检测，如果出现明显的非特异条带信号，则需要更换一抗，以避免In-CellWestern结果中的非特异信号In-CellWesternProtocol-5-Ⅳ.实验结果EGF刺激后同时定量检测EGFR磷酸化水平和EGFR总蛋白700通道检测磷酸化EGFR700&800通道800通道检测EGFR总蛋白图1.通过磷酸化EGFR（Tyr1045）的特异抗体检测A431细胞对EGF的剂量效应。用700通道和800通道在96孔板上作In-CellWestern分别检测EGFR总蛋白（作为校正蛋白）和磷酸化EGFR。背景孔内只加二抗而不含一抗。左图表示相对定量数值，代表EGFR的磷酸化水平In-CellWesternProtocol-6-EGF刺激后同时定量检测EGFR磷酸化水平和ERK总蛋白700&800通道700通道检测磷酸化EGFR800通道检测ERK总蛋白图2.通过磷酸化EGFR（Tyr1045）的特异抗体检测A431细胞对EGF的剂量效应。用700通道和800通道在96孔板上作In-Cel