CliniMACS介绍

1美天旎细胞治疗平台CliniMACS系统简介第一部分、德国美天旎生物技术有限公司及MACS细胞分离技术介绍第二部分、CliniMACS系统在临床细胞治疗中的应用一、CliniMACS细胞分选仪及其配件介绍二、CliniMACSCD34系统的安全性德国美天旎生物技术有限公司上海市仙霞路319号远东国际广场A栋2301室200051电话：[phone]传真：[phone]服务热线：8008202606北京市东城区朝阳门内大街银河SOHOD座50723室100010电话：[phone]传真：[phone]细胞分离技术介绍德国美天旎生物技术有限公司（MiltenyiBiotecGmbH）是一个以细胞分选技术为主、拥有多样化产品的生物技术公司。开发研制并销售世界上最先进的细胞分选、细胞生物学、相关分子生物学产品和技术，尤其在干细胞分选、DC细胞分选与分析、细胞因子分泌细胞分选与分析、免疫治疗、再生医学方面占有极大的优势，CD133、BDCA-2（CD303）、BDCA-4（CD304）单抗为我公司专利产品。我公司总部位于德国科隆，在科隆和德国北部罗斯托克均有cGMP生产机构。我们的产品有免疫磁珠、特异性细胞及蛋白质或者DNA/RNA分选用的MACS分选设备、单克隆抗体、无菌溶液、基础和特殊培养基、血液/血浆治疗用的生物学吸附剂、LIFE18血浆分离机、流式细胞仪及相关耗材。MACS技术已成为细胞分选的标准方法，从实验室到临床，从小规模到大规模，从常见细胞到稀有细胞和复杂的细胞亚群，从人类和小鼠细胞到其它种系的细胞，MACS技术提供了可在每个实验室进行高品质细胞分选的方法。MACS技术原理MACS技术为德国美天旎生物技术有限公司的专利产品，是一种集合了免疫学、细胞生物学、磁力学等知识于一体的高度特异性细胞分选技术，其高度特异性来自抗体对抗原的特异性识别。主要组成成分为MACS微珠、MACS分选柱和MACS分选器。MACS微珠是与高度特异性单克隆抗体相偶联的超顺磁化微粒。MACS分选柱置于一个永久性磁场—MACS分选器中，可以将磁力增强1000倍，足以滞留仅标记极少量微珠的目的细胞。用缓冲液冲洗分选柱，所有未标记的细胞被冲洗掉。分选柱离开磁场，即可获得被标记的细胞组分。所有的操作在2.5~30分钟内即可完成，得到的细胞可立即用于后继实验。MACS技术优点1、稳定、高质量的分选——使用MACS技术，可获得高纯度（90-99%)、高回收率的分选细胞群。2、对细胞无损伤——50nm微珠和MACS分选柱均无毒性，对细胞无损伤，可以纯化有活力和功能活性的细胞而不影响其活性。3、操作简便、快速——MACS技术操作简单，消毒方便。磁珠孵育时间很短，仅需15分钟。手动分选可在30分钟内完成，autoMACS分选可在2.5-10分钟之内完成。4、从实验室到临床——MACS技术可以实现从105到1011个细胞分选。如果使用频率高，可选用autoMACS；密闭系统内无菌分选细胞，可选用CliniMACS。5、分选后细胞适用于后续实验——流式细胞术、显微镜分析和分子生物学研究显示MACS分选对细胞没有任何影响。分选后细胞适用于细胞培养和体内实验。此外，分选得到的标记和未标记细胞组分均可回收利用。6、从细胞到分子分选——MACS技术不仅可以分选各种细胞，还可以分选转染细胞、亚细胞物质、蛋白质、DNA、RNA及mRNA。MACS分选策略有两种基本的分选策略：阳性分选和去除分选。复合分选策略是将两种基本分选策略相结合或者联合使用多选微珠，从而实现细胞亚群的分选。1、阳性分选策略（Positiveselectionstrategy）阳性分选中，目的细胞被磁性标记后，作为阳性标记组分直接分选出来。分选后的细胞不必去除MACS微珠，可立即用于培养或者后续操作。该方法可以将磁性标记的靶细胞富集10000倍。阳性分选策略优点：纯度高，回收率高，操作迅速、简便。32、去除分选策略（Depletionstrategy）去除分选是把非目的细胞磁性标记后从细胞混合物中去除的方法，即未磁性标记的细胞为目的细胞。MACS分选柱技术加上强磁性标记可以去除高达4个对数级的细胞。去除分选策略适用范围：去除不需要的细胞；缺乏针对目的细胞的特异性抗体（如肿瘤细胞）；不需要抗体和目的细胞结合，即细胞不被激惹4（如T细胞、B细胞、NK细胞功能分析）；复合分选的一部分。3、复合分选策略：联合使用两种以上分选策略，主要用于细胞亚群的分选或者得到高纯度非常稀有的细胞。（1）去除后再阳性分选（Depletionfollowedbypositiveselection）细胞亚群的分选，可以先磁性标记非目的细胞，去除分选后对阴性组分再行磁性标记和阳性分选。适用范围：在细胞悬液中，非目的细胞也表达用来阳性选择目的细胞的抗原，就需要先去除这群非目的细胞；如果要分选非常稀有细胞，先从细胞悬液中去除非目的细胞，在富集细胞的基础上，进行阳性分选，可获得高纯度目的细胞。（2）多重分选策略（MultiSortStrategy）MACS多重分选是一种根据多种表面标志磁性分选细胞的技术。多重分选中，首先用MACS多选微珠标记目的细胞，进行第一参数阳性分选。然后细胞与多选解离试剂共同孵育，后者可以将微珠从抗体上酶性解离下来。接着使用针对另一细胞表面标志的抗体－微珠复合物磁性标记阳性分选细胞。二次标记的细胞可以再次进行阳性分选或者去除分选。5第二部分、细胞分离技术在临床细胞治疗中的应用一、CliniMACSPlus细胞分选仪及其配件介绍1.CliniMACSPlus细胞分选仪CliniMACSPlus（产品号:155-01，见图）是一台密闭的全自动的电动机械仪器，联合CliniMACS试剂，如CliniMACSCD34试剂（产品号:171-01）、CliniMACS管道（如产品号:161-01）和CliniMACSPBS/EDTA缓冲液（产品号:700-25），临床上用于从人体混合细胞群体中分选出特定的细胞亚群。结构组成及原理CliniMACSPlus是一应用MACS®技术的自动细胞分选仪。它是一封闭的无菌系统，可应用于临床治疗所需的大容量细胞的纯化或非需要细胞的祛除。此分选仪的主要组成包括完整的计算机系统、磁性分选单位、蠕动泵和各种操作阀。计算机系统控制仪器内所有其它部件，指导系统按设定的标准运行，执行各种重复性的程序。磁性分选单位包括一可移动的永久磁铁和分选柱支架。蠕动泵控制整个管道内的液体流速，并和操作阀一起控制缓冲液和细胞悬液的流速。先在细胞准备袋内用细胞特异性抗体磁性标记靶细胞，标记后，洗涤细胞以去除多余的抗体。然后，含标记靶细胞细胞的准备袋与管道连接，后者依次连接CliniMACS缓冲液袋和细胞收集袋。分选程序开始后，此分选仪运行时使细胞自动通过分选柱，随后进行一系列洗涤步骤，最后靶细胞从分选柱洗脱并收集。CliniMACSPlus分选仪和CliniMACS细胞分选系统的其他产品提供了高纯度和高回收率的大剂量细胞的分选。CliniMACS细胞分选系统包括CliniMACSPlus分选仪，CliniMACS管道，CliniMACS试剂，和CliniMACS缓冲液。预期用途CliniMACSPlus分选仪和CliniMACS细胞分选系统是在欧洲通过CE认证的医疗仪器，可用于临床各类人体细胞的分选。CliniMACS试剂包括用于分选干细胞，单核细胞，树突状细胞(DC)，NK细胞，B细胞和T细胞亚群。预期治疗内容：血液系统恶心肿瘤：白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、小儿神经母细胞瘤等血液系统非恶性肿瘤：再生障碍性贫血、小儿地中海贫血等自身免疫性疾病：SLE、MSc等神经系统疾病：小儿脑瘫、脊髓损伤、脑出血后遗症等心脏缺血性疾病：心肌梗塞、缺血性心肌病、不稳定性心绞痛等外周血管闭塞性疾病：肢端缺血、糖尿病足等国外的分类在欧洲国家，加拿大，和澳州，CliniMACSPlus分选仪和CliniMACS细胞分选系统有关6产品均在医疗器械法规下注册，并分类如下：CliniMACSplus分选仪-第二类b医疗器械CliniMACSPBS/EDTA缓冲液-第二类a医疗器械CliniMACS管道-第二类b医疗器械CliniMACS试剂-第三类医疗器械在美国，CliniMACSPlus分选仪和CliniMACS细胞分选系统允许在研究药物研究申请（IDE）或研究仪器豁免申请（IND）核准下使用。可供参考文献举列一些国内外发表的论文以印证CliniMACSPlus分选仪和CliniMACS细胞分选系统的细胞分选有效性和分选不同靶细胞的临床应用如下：2.CliniMACS细胞分选仪配套设备介绍：1)低速大容量离心机(Sorvall,RC3型号或相当产品)要求：离心杯足够大适合放入装600ml的血袋，离心能控制在19~25℃，制动可以调节（即低速大容量离心机，一般血库可能会有）。2)无菌操作台。3)可以调零的电子显示秤（精确至1克，最大称量为1000-2000克）4)软管热封口器（即热合器，Baxter公司，或类似产品）5)血浆分离夹（血库一般有此设备）6)非间断电源：如果医院有可能停电则必需准备要求：最低180VA，持续90min（APC,Smart-UPS1400I）7)摇床：（Lab-line,Model4635或相当产品）要求：转速25rpm(抗体标记时用，用手摇替代也可)二、CliniMACSCD34系统的安全性1.1.CliniMACS®CD34系统TheCliniMACS®CD34系统包含CliniMACS®CD34试剂、CliniMACS®管道、CliniMACS®LS管道、CliniMACS®PBS/EDTA缓冲液和CliniMACS®plus仪器（CliniMACS®软件程序CD34SELECTION1和CD34SELECTION2用于体外从不同种类的造血干细胞群中富集人CD34阳性细胞。TheCliniMACS®CD34试剂是一次性使用的、无菌的、有生物相容性的CD34抗原特异性试剂；用于磁性标记和富集CD34+细胞。TheCliniMACS®管道和CliniMACS®LS管道是一次性使用的、无菌的、有生物相容性的管道，包含有细胞分选柱，保证自动的细胞分选在密闭、无菌的液体通道中进行。TheCliniMACS®PBS/EDTA缓冲液是无菌、有生物相容性的等张缓冲液，用于体外细胞分选时的细胞洗涤和液体运输。CliniMACS®plus仪器是软件控制的设备，操纵体外的细胞分选过程。CliniMACS®软件程序CD34SELECTION1配合CliniMACS®管道，或CD34SELECTION2配合CliniMACS®LS管道使用。然而，用于体外富集人CD34+细胞的CliniMACS®CD34系统对于分选的细胞和临床治疗无任何建议。人类细胞的制造和使用必需遵循国家的法律法规。1.2.结果1.2.1.R&D内部结果7研发部门在常规的研发过程中进行了96次CliniMACS®CD34分选。分选样本不同于临床应用的样本，所用的细胞是从志愿者中采集的未动员的白细胞采集物，极少部分使用的是志愿者经G-CSF/GM-CSF动员后的全血白细胞采集物。因此，所得的数据（纯度、回收率）不能直接当作临床数据，但是可以用于分析分选过程。与临床志愿者动员后的细胞分选结果相似，CD34回收率的上、下限范围非常大，平均回收率(除外样本准备过程)75.0%，没有明显增减。CD34平均纯度78.0%，因为样本不同，不能直接比作临床数据。内部CD34起始频度比临床细胞的频度低。最终的纯度取决于仪器操作和数据输入（尤其是CD34起始频度）。相反，被动去除非CD34细胞(“-logP”)只是分选程序的一个功能，平均被动去除非CD34细胞3.6log.没有明显增减。1.2.2.临床结果文献来源于同级评审