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各厂家超分辨技术 1、莱卡公司采用的超分辨技术STED 2000年，德国科学家StefanHell开发了另一种超高分辨率显微技术，其基本原理是通过物理过程来减少激发光的光斑大小，从而直接减少点扩散函数的半高宽来提高分辨率．当特定的荧光分子被比激发波长长的激光照射时，可以被强行猝灭回到基准态．利用这个特性，Hell等开发出了受激发射损耗显微技术(stimulatedemissiondepletion,STED)．其基本的实现过程如图2所示，就是用一束激发光使荧光物质(既可以是化学合成的染料也可以是荧光蛋白)发光的同时，用另外的高能量脉冲激光器发射一束紧挨着的、环型的、波长较长的激光将第一束光斑中大部分的荧光物质通过受激发射损耗过程猝灭，从而减少荧光光点的衍射面积，显著地提高了显微镜的分辨率,原理见下图。 STED成像技术的最大优点是可以快速地观察活细胞内实时变化的过程，因此在生命科学中应用更加广泛. 2、蔡司公司采用的超分辨技术PLAM 2002年，Patterson和Lippincott‐Schwartz首次利用一种绿色荧光蛋白(GFP)的变种(PA‐GFP)来观察特定蛋白质在细胞内的运动轨迹．这种荧光蛋白PA‐GFP在未激活之前不发光，用405nm的激光激活一段时间后才可以观察到488nm激光激发出来的绿色荧光．德国科学家EricBetzig敏锐地认识到，应用单分子荧光成像的定位精度，结合这种荧光蛋白的发光特性，可以来突破光学分辨率的极限．2006年9月，Betzig和Lippincott‐Schwartz等首次在Science上提出了光激活定位显微技术(photoactivatedlocalizationmicroscopy,PALM)的概念．其基本原理是用PA‐GFP来标记蛋白质，通过调节405nm激光器的能量，低能量照射细胞表面，一次仅激活出视野下稀疏分布的几个荧光分子，然后用488nm激光照射，通过高斯拟合来精确定位这些荧光单分子．在确定这些分子的位置后，再长时间使用488nm激光照射来漂白这些已经定位正确的荧光分子，使它们不能够被下一轮的激光再激活出来．之后，分别用405nm和488nm激光来激活和漂白其他的荧光分子，进入下一次循环．这个循环持续上百次后，我们将得到细胞内所有荧光分子的精确定位．将这些分子的图像合成到一张图上，最后得到了一种比传统光学显微镜至少高10倍以上分辨率的显微技术，原理如下： PLAM通过定位细微结构乃至单分子，实现 20 nm 的横向分辨率和 50 nm 轴向分辨率。 大鼠少突胶质细胞线粒体 3、尼康公司采用的超分辨技术STROM和SIM STROM: 2006年底，美国霍华德‐休斯研究所的华裔科学家庄晓薇实验组开发出来一种类似于PALM的方法，可以用来研究细胞内源蛋白的超分辨率定位．他们发现，不同的波长可以控制化学荧光分子Cy5在荧光激发态和暗态之间切换，例如红色561nm的激光可以激活Cy5发射荧光，同时长时间照射可以将Cy5分子转换成暗态不发光．之后，用绿色的488nm激光照射Cy5分子时，可以将其从暗态转换成荧光态，而此过程的长短依赖于第二个荧光分子Cy3与Cy5之间的距离．因此，当Cy3和Cy5交联成分子对时，具备了特定的激发光转换荧光分子发射波长的特性．将Cy3和Cy5分子对胶联到特异的蛋白质抗体上，就可以用抗体来标记细胞的内源蛋白．应用特定波长的激光来激活探针，然后应用另一个波长激光来观察、精确定位以及漂白荧光分子，此过程循环上百次后就可以得到最后的内源蛋白的高分辨率影像，被他们命名为随机光学重构显微技术(stochasticopticalreconstructionmicroscopy,STORM)．2007年，他们进一步改进STORM技术，发展了不同颜色的变色荧光分子对，可以同时记录两种甚至多种蛋白质的空间相对定位，从而阐明笼形蛋白clathrin形成的内吞小泡与细胞骨架蛋白之间的精确空间位置关系，两种颜色的分辨率都可以达到20～30nm,原理如下图： STORM通过一对染料对通过随机发光空间定位，实现了XY 20 nm分辨率。 SIM: 改变光学的点扩散函数来突破光学极限的另一个方法是利用饱和结构照明显微技术(saturatedstructureilluminationmicroscopy,SSIM)．早在1963年，Lukosz和Marchand就提出了特定模式侧向入射的光线可以用来增强显微镜分辨率的理论2005年，加州大学旧金山分校的Gustafsson博士首先将非线性结构性光学照明部件引入到传统的显微镜上，得到了分辨率达到50nm的图像．SSIM技术的原理是将多重相互衍射的光束照射到样本上，然后从收集到的发射光模式中提取高分辨率的信息.如图所示. SIM通过结构照明莫尔纹原理实现了任何荧光染料都可以达到XY 100nm . EMCCD拍摄 SIM拍摄 4、奥林巴斯公司采用的OSR技术 图像超分辨率重构(superresolution,SR)是指利用计算机将一幅低分辨率图像(lowresolution,LR)或图像序列进行处理，恢复出高分辨率图像(highresolution，HR)的一种图像处理技术。奥林巴斯超分辨技术通过高倍60X或者100X油镜通过缩小共聚焦上的针孔用强激光将样品扫描20~50次后通过软件进行运算重构，此技术存在一定的局限性：1、必须使用高倍油镜低倍不适用2、因缩小针孔需使用强激光对样品损伤比较大。3、对样品扫描20~50次，样品荧光淬灭严重，更不适用于活细胞。4、环境要求较高，在做20~50次的过程中因环境振动等引起最后软件运算不准确。5、共聚焦图片均为软件着色，不能做多色荧光标记，容易引起串色。