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《微生物培菌工》技能训练指导书江苏食品职业技术学院生物工程系编制二○○四年四月1微生物培菌工技能训练指导书一、微生物实验室主要设备与样品采集（一）实验室主要仪器设备1、光学显微镜及镜检仪器：光学显微镜、接目测微尺、接物测微尺、血球计数器、测微网、显微镜灯、日光灯等照明设备。2、消毒、灭菌设备：高压蒸汽灭菌锅、铝锅、干燥箱、电炉、酒精灯、喷雾器、紫外光灯等。3、微生物培养设备；恒温培养箱、液体培养振荡器、培养皿、三角瓶、试管等。4、微生物分析设备和仪器：无菌室、无菌操作箱、超净工作台、振荡器、混合器、组织捣碎器、高速离心机、天平、接种针、接种环、镊子、剪刀、仪器盘、平皿、吸管、载玻片、盖玻片、广口瓶、试管架、特种蜡笔、记号笔、纱布、铁丝筐等。5、菌种保藏设备：冰箱。6、霉菌毒素一般测试仪器：层析缸、电动吹风机等。7、专项仪器：恒温水浴锅、注射器、涂布棒、放大镜、自动温度计、自动湿度计等。8、采样工具：铲子、匙、采样器、塑料袋等。9、通风设备：通风橱、无菌室通风设备等。（二）微生物学检验的样品采集1、样品采集的目的样品的采集简称采样。采样是从生产和经营的产品中，按照采样规定采集检验样品的过程。通过对检样的微生物学检验，可以准确评价产品状况，并为保证产品质量改进管理提供依据。2、样品采集的要求采集样品的基本要求是：第一，样品必须具有代表性。第二，样品要妥善存放，严防污染。第三，样品必须及时送检和检验。采样前，应事先准备好经过灭菌的容器和采样工具。在无菌条件下，按国家有关样品采集标准均匀而准确地取样，使样品具有正确性和代表性。存放样品，应用灭菌后的纸袋或玻璃器皿为好，通常不宜直接使用塑料袋存放。采集后的样品，必须及时封口，做好记录，贴上标签，每件样品必须标记清楚（如样品名称，采样地点，时间，储藏情2况，数量，食用或中毒情况。采集或送检单位及姓名，采样现场的温度、湿度及卫生状况等）。尽量保持样品的原始状态，是保证检验结果准确性的基本条件。微生物学检验还必须具有及时性。样品送到微生物检验室应越快越好，有一般不超过３小时，如果路途遥远，可将样品保持在0―5℃环境中。3、样品采集的方法(1)采样用具宜选用耐消毒灭菌的材料。使用前，应进行认真清洁干燥和相应的灭菌处理。湿热灭菌121℃至少20分钟，干热灭菌170℃至少1小时。不能用消毒剂消毒，样品中也不得加入防腐剂，以免影响检验结果的准确性。采样时应严格遵守无菌操作。(2)采样方法与步骤在无菌操作条件下，按有关国家规定标准采集样品：样品是固体粉末，应边取边混合；是液体，则通过振荡可混匀；检样是冷冻食品，应保持在冷冻状态（可放在冰内，冰箱的冰盒内或低温冰箱内保存）；非冷冻食品须在0―5℃环境中保存。采样数量按国家有关规定执行。二、微生物的镜检技术（一）普通光学显微镜的使用和保养1、普通光学显微镜的构造和性能光学显微镜主要由光学系统和机械系统两部分组成。光学系统是应用光学原理经过透镜使被检物体的物象放大。机械系统具有支架作用，并有调节装置。(1)光学系统显微镜的光学系统主要有物镜和目镜组成。此外，还有反光镜、聚光镜等。1)物镜物镜是由多组透镜组成，分为干燥系和油浸系两组镜头。干燥系镜头是指镜检时物镜和镜检物之间的介质空气的物镜，通常可分为两种：一是低倍镜，二是高倍镜。油浸系镜头是指镜检时物镜和镜检物之间的介质是折光率玻片和镜头相似的油类（如香柏油），镜头浸入油中而进行调焦镜检的镜头，这样可避免光线通过空气时发生散射现象，从而保证视野亮度，提高镜头分辨率。2)目镜目镜装在镜筒上方，它是由两块透镜组成，它可将物镜所造成的实像进一步放大形成虚像，并映入眼部。目镜不增加分辨率。显微镜的放大倍数是目镜和物镜放大倍数的乘积，但从提高分辨率的实际效果来3看，还是选用放大倍数较高的物镜为好。3)聚光镜聚光镜一般由两个或几个透镜组成，它可以使光线从正面和斜面照射到标本后进入物镜，形成一个大角度的锥形光柱，以提高物镜的分辨率。4)反光镜它是普通光学显微镜的取光设备，装置在镜座上。它是个双面镜子，一面是平面镜，另一面是凹面镜，镜体可在弧弓上自由翻转以调整位置，使光线射向聚光镜。5)光源自然光线和灯光均可作为光源，以灯光较好，因为光色和强弱都可以得到控制。(2)机械系统显微镜的机械系统主要由镜座、镜臂、镜筒、调节器、转换器、载物台和标本推动器等部件组成。1)镜座镜座是显微镜的基座，在镜体的底部，用以支持整个镜体。2)镜臂镜臂是显微镜的脊梁，机械装置一般都直接或间接地与其相接，用以支撑与连接镜筒和镜座。3)镜筒镜筒上端安装目镜，下端连接转换器。4)转换器转换器是由两个金属碟组成，上面一个固定在镜筒上，下面一个可转动，在其上安装物镜，转换器可按需要来转动以更换物镜。5)调节器调节器是升降镜筒或镜台，调节物镜和标本间距离调焦的机件，分为粗调节器和细调节器。6)载物台载物台又称镜台，用于放置镜检物，台上装有标本推动器。7)标本推动器标本推动器又称十字动台，安装在载物台上，标本推动器一方面用来固定标本，另一方面通过旋转推动器上的螺旋，可使标本前后左右移动，便于检查标本的不同部位。2、光学显微镜的使用(1)取镜显微镜是贵重的精密仪器，取镜时一手握镜臂，一手托镜座轻拿轻放，切忌碰撞和猛震，以免光学系统光轴偏斜，影响使用。(2)采光与调焦对光时，要将低倍镜与镜筒成一直线，用左眼看目镜内，同时调节反光镜寻找光源，4调节到全视野有均匀的明亮度，照明效果到最佳时为止。可通过开大或缩小光圈、升降聚光镜、旋转反光镜等来调节光线。使用显微镜必须调焦。先粗调至镜检物呈模糊状，在细调至镜检物清晰为止。(3)镜检镜检时，将玻片标本放在载物台上，对准通光孔，并用标本推动器或标本夹将其固定，然后按照先用低倍镜后用高倍镜在油镜的原则，依次观察。1)低倍镜观察任何标本都先经过低倍镜观察。首先移动推动器，使标本处于低倍镜的正下方，旋动粗调节器，物镜降到距标本5mm处，用左眼由目镜向下看，慢慢使镜筒上升，直至发现视野中有被观察的物象后，再使用细调向下或向上移动，直到能清楚地看到标本为止，将要观察的标本目标移至视野中央，以备换高倍镜或油镜镜检。2)高倍镜观察显微镜的成套物镜，一般设计为共焦点，低倍镜对准焦点后，移动转换器，改换高倍镜后基本上也对准焦点，只要稍微转动细调即可。3)油镜观察高倍镜下找到所要观察的目标后，移动转换器，在标本的欲检部位加一滴香柏油，改换成油镜，只要稍微转动细调即可。4)记录使用显微镜时，用左眼观察目标，右眼看记录本，以便边观察边记录。5)收镜与存放镜检结束后，把标本取下，擦净显微镜各部，将镜头转成“八”字行，再将镜筒向下调节以免物镜与聚光镜相碰受损，然后将显微镜放入镜箱内，妥为保存。3、普通光学显微镜的保养(1)显微镜应避免直接在阳光下暴晒。(2)显微镜及镜头严禁随意拆卸。(3)显微镜应保持干净，尤其是目镜和物镜必须保持高度清洁，如有不洁，机械部分用软布擦净，光学系统用擦镜纸擦拭。(4)油镜使用后，用擦镜纸沾二甲苯擦拭，再用擦镜纸把镜头擦净。(5)微镜调焦时，如为镜筒升降者，只准升，不能降；如为镜台升降者，只准降，不能升。(6)显微镜使用时或装箱存放后，均需注意防潮、防霉、防晒、防震。(二)测微与计数1、测微5测微就是测量微生物的大小，其大小用测微尺来测定，测量微生物个体大小是微生物分类鉴定中一项重要工作。测微尺包括两种：接物测微尺和接目测微尺。(1)测微尺的构造1)接目测微尺简称目尺，是一圆形玻片，玻片中央有一刻度尺，使用时装入目镜内的光阑处。2)接物测微尺简称物尺，是放在载物台上的一块玻片。在它的中央有一条长1mm被分成100个小格的等分线，每一小格长0.01mm即10um。(2)测微尺的使用1)目尺显微长度的标定因目尺是安装在目镜中，所测得的物象均已被物镜放大，因此在使用放大倍数不同的物镜时，目尺的显微长度（即目尺每小格代表经过显微放大的实际长度）是不一致的。所以在不同放大倍数的镜头系统下，必须分别用物尺来标定目尺每格的显微长度。目尺显微长度标定的具体方法如下：先将目尺装入目镜内，刻度向下，并将物尺放在载物台上，使刻度朝上。按镜检的方法，在镜下找到物尺的刻度，再转动目镜，使两尺刻度平行，并使两尺第一条刻度线重合，向右寻找第二条相重合的刻度线。记录两个重叠刻度线间目尺和物尺的格数，根据下列公式计算目尺的显微长度。目尺显微长度=（两个重叠刻度线间物尺的格数/两个重叠刻度线间目尺的格数）×10（微米）2)微生物菌体大小测量在目尺的显微长度确定以后，便可取下物尺，放上欲测定其大小的微生物玻片标本，进行测微。首先，在视野中选取一个单独的菌体，以横和纵的方向来测量，视其相当目尺刻度多少格，再乘以目尺显微长度，即可算出菌体的大小。2、微生物的显微计数显微计数是在显微镜下直接计算菌液中微生物数量的方法。显微计数法有三种，即计数器测定法、视野计数法和目镜计数网测定法。这里主要介绍计数器测定法。计数器测定法是利用血球计数板测定单位容积（或重量）内微生物数量的一种方法，适用于细菌、真菌孢子、酵母菌细胞及病原菌的直接显微计数。(1)血球计数板的构造（以25×16规格计数板为例）血球计数板的构造是一块厚的载玻片中央两边各有一个计数室，计数室的长宽各是1mm，深度为0.1mm，其容积为0.1mm3。0.1mm3的计数室又均分为25个中格，每个6中格又分成16个小格，因此有计数室0.1mm3=25中格=400小格。(2)血球计数板的使用与计算操作时，先将血球计数板、吸管、盖玻片充分洗净，并使其干燥，再用盖玻片盖在计数室上，然后用吸管吸取稀释菌悬液放在盖玻片的边缘上，待菌液自行渗入计数室内，然后在高倍镜下观察计数，计数左上、左下、右上、右下及中央五个中格内细胞数，每个样品重复计数三次，取其平均值。计算公式是：样品菌量（个/ml）=（五个中格内细胞数之和/80）×400×104×稀释倍数（三）微生物的镜检技术1、细菌的镜检细菌镜检的项目为：细菌的形态、大小。革兰氏染色反应，有无芽孢、荚膜、鞭毛及细胞运动情况等。在细菌形态观察中，必须借助于染色的方法，使菌体着色，增加与背景的明暗对比，才能在光学显微镜下较为清楚地观察其个体形态和部分结构。细菌染色法分为：单染色法和复染色法。(1)单染色法单染色法是用一种染料染色，适用于菌体一般形态观察。操作过程如下：涂片→干燥→固定→染色（1～2分钟）→水洗→吸干→晾干→镜检(2)复染色法复染色法是用两种或多种染料进行染色，最常用的是革兰氏染色法。所有细菌经革兰氏染色后可以分为两类：一类是革兰氏阳性菌，呈紫色；一类是革兰氏阴性菌，呈红色。革兰氏染色法的操作过程如下：涂片→干燥→固定→结晶紫初染1分钟→水洗→路氏碘液媒染1分钟→水洗、吸干→95%乙醇脱色→水洗、吸干→番红复染30秒钟→水洗、吸干→晾干→镜检在进行革兰氏染色过程中，以涂片和酒精脱色这两步骤最为关键。2、酵母菌的镜检酵母菌镜检的主要项目有：营养细胞的形状大小和出芽繁殖的特征，有性繁殖和假菌丝的有无等特征。(1)制片方法观察酵母菌的基本形态，可用水浸法制片，于显微镜下观察。方法如下：在洁净的7载玻片上加一滴生理盐水，用接种环以无菌操作方法从培养48小时的固体斜面上取少量酵母菌与水混匀至浑浊即可；亦可直接从液体培养基中沾取一环菌液于载玻片上，加盖盖玻片，在显微镜下即能清楚地看到酵母菌的形态及其出芽繁殖的特征。(2)染色方法美蓝染色法：取美蓝染色液滴加在洁净载玻片中央，用接种环取少量酵母菌于美蓝液中，加盖盖玻片镜检，在显微镜下可见到死细胞被染成蓝色，活细胞则无色透明。因为活细胞新陈代谢旺盛，细胞内还原能力强，能将进入细胞的美蓝还原成无色，而死细胞失去代谢活力，被染成蓝色。3、霉菌的镜检在镜检，首先观察霉菌培养基上的培养性状（菌落形状、大小、颜色、质地等），然后再进行镜检。霉菌镜检项目为：营养体的类型、营养菌丝是否分化、无性繁殖和有性繁殖的类型、形态、颜色、大小及其着生方式。在霉菌形态研究中，主要采用制片镜检和活物镜检两种方法。(1)培养物的直接观察用尖头镊子或接种针挑取