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23重组DNA技术简介目的与要求了解基因工程的相关技术和基因工程的应用及其成果；掌握重组DNA的基本步骤；理解基因工程主要的工具酶和基因克隆的质粒载体23.1基因工程的相关技术1.DNA的【变性】与【复性】、杂交分子2.分子探针寻找特定基因（图23.1）对探针的要求：纯一单链3.Southern印迹与Northern印迹Southern:分析基因的结构Nothern:确定基因的表达利用RNA探针探查基因4.原位杂交•检测不同类型细胞组成的组织中特定mRNA在单个细胞中的表达情况•FISH（荧光原位杂交）5.聚合酶链（式）反应（PCR）快速扩增特定的基因或DNA序列过程：高温变性，低温退火，适温延伸PCR23.2基因工程主要的工具酶23.2.1限制性内切核酸酶•在特定的DNA位点切断DNA。•酶切位点就在其识别序列内，识别序列最常见的为4或6个核苷酸对所组成。•切割方式：黏性末端平齐末端23.2.2DNA连接酶•催化DNA中相邻的3-羟基和5-磷酸基末端之间形成磷酸二酯键并把两段DNA拼接起来。•切口P298•缺口P298DNA连接酶的活性限制酶与连接酶的作用23.2.3反转录酶•从mRNA反转录合成cDNA的23.3基因克隆的质粒载体载体是一种可以将外源DNA片段送入宿主细胞进行扩增或表达的运载工具。质粒：一些在细菌中独立存在于其染色体之外，能够自主复制的小型双链环状DNA分子。高质量质粒的要求（P299）•具有复制起始点•携带易于筛选的选择标记•多克隆位点•小分子量高拷贝数•安全性pBR32223.4重组DNA的基本步骤23.4.1获得目的基因1.限制性内切酶酶切产生待克隆的DNA片段•部分酶切，完全酶切，基因文库2.人工合成DNA3.反转录酶酶促合成法•cDNA文库4.聚合酶链（式）反应扩增特定的基因片段23.4.2DNA分子的体外重组•将外源基因插入载体黏性末端连接法平齐末端连接法23.4.3重组DNA分子引入宿主细胞和筛选鉴定1.重组DNA引入宿主细胞•热冲击•电转化2.重组克隆的筛选与鉴定•抗生素抗性基因的利用在细菌质粒中克隆基因的全过程23.5基因工程的应用及其成果简介1.生产新型疫苗、胰岛素和人的生长激素•低成本，安全2.动物基因工程与畜禽品种改良•转基因鱼、猪•生物反应器（表23-1）3.在遗传病的基因诊断和基因治疗中的作用•【基因治疗】•生殖系统基因治疗的安全问题•基因诊断23.6遗传工程的风险和伦理学问题病原微生物等的风险•安全措施和规则伦理学问题•自然力量的使用和自然和谐的打破•基因治疗的安全性（对后代的改变）基本概念和知识点变性、复性、杂交、Southern印迹、Northedrn印迹、聚合酶链式反应、载体、完全酶切、部分酶切作业限制酶酶切DNA有几种方式？平齐末端与黏性末端是怎样产生的？举例说明。补充材料限制性核酸内切酶（restrictionendonucleases），简称限制酶，是一类能识别和切割双链DNA分子中的某些特定核苷酸序列的核酸水解酶，主要从细菌中分离得到。根据结构和功能特性，把限制酶分为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型。Ⅰ型限制酶的切点不固定，很难形成稳定的、特异性切割末端；Ⅲ型限制酶对DNA链的识别序列是非对称的，不产生特异性的DNA片段，故基因工程实验中基本不用Ⅰ型和Ⅲ型限制酶。血源性乙肝疫苗是用无症状的HBsAg携带者的血液制成。它的制备步骤大致为：采用高滴度HBsAg阳性携带者的血液，分离出血浆且除去其中有感染的HBV颗粒后，再将浓缩与纯化HBsAg进行充分灭活，以消灭其中可能存在的一切已知病毒以及消除HBsAg表面可能存在的全部宿主蛋白，然后添加佐剂及防腐剂而成。为确保疫苗的安全性，每一阶段均需取样做无菌试验、热源试验及动物安全试验等，以检查疫苗中是否存在其他病原体及血液中的抗原物