活版印刷技术原位合成DNA微阵列

中国科学B辑化学2006,36(6):493~500493SCIENCEINCHINASer.BChemistry活版印刷技术原位合成DNA微阵列汤建新①②陈洪③何农跃②**(①湖南工业大学绿色包装与生物纳米技术应用湖南省重点实验室,株洲412008;②东南大学分子电子学国家重点实验室,南京210096;③中南林学院林业部经济林育种与栽培重点实验室,株洲412006)摘要研究了一种基于活版印刷原理的中低密度基因芯片原位合成新方法,该方法完全避免了掩模制备过程,合成速度快、制备成本低、便于批量生产,有望满足人们日益增长的对批量基因信息进行快速、低成本检测与分析的要求.对活版印刷法寡核苷酸原位合成原理、合成工艺进行了详细探讨,设计加工了一套手动压印微阵列的合成装置,并对自驱动单体溶液微通道纤维管进行了筛选.应用该方法在连接有手臂分子的载玻片上,分别合成了4条探针、16和160个位点的寡核苷酸微阵列,通过与互补的靶序列杂交和荧光分析,微阵列上相同寡核苷酸探针的位点荧光强度均匀,表明其寡核苷酸探针分布均匀;错配分析还表明得到的寡核苷酸微阵列能实现单个碱基错配的检测.关键词活版印刷寡核苷酸原位合成DNA微阵列收稿日期:2006-01-19;接受日期:2006-02-20*国家自然科学基金(批准号:60571001,20505020,60571032,60071001,60121101)、国家“863”专题计划(批准号:2006AA03Z357)和湖南省自然科学基金(批准号:04jj40023)资助项目**联系人,E-mail:[e-mail],[e-mail]目前DNA芯片制备技术的发展呈现两大趋势:其一是以Affymetrix公司为代表的向高密度、高通量、高度并行性基因芯片发展,试图把对应于人类所有基因的相应探针都固定在一块芯片上,它的发展将对生命科学的基础与应用研究起到革命性的推动作用,并有可能在将来引发新的革命;另一种趋势是以Nanogen公司为代表的过程集成化趋势,由于在实际临床诊断及军事、司法应用中,大多数情况下并不需要高密度的DNA芯片,而是要求密度适中、但特别简单、灵活、速度快、成本低、易于操作、质量可靠的芯片制备方法和技术.因此,发展中、低密度的DNA芯片可能有着很大的实际应用前景和很大的潜在市场,并可能取得重大的经济和社会效益.因此,无论是高密度,还是中、低密度基因芯片,在生物检测、医学检验和疾病诊断、药物筛选以及基因序列分析上都有着极其重要的意义[1~8].在基因芯片制备技术中,中、低密度的芯片制备一般采用点样法[9].但它存在着两大缺陷:其一是当制备密度较高的核苷酸探针微阵列时成本很高,例如,当20目碱基的探针数量达到1000条时,探针成本即在100000元人民币以上,因而当探针数目较多时,这一技术无法与原位合成技术相比拟;其二是当494中国科学B辑化学第36卷SCIENCEINCHINASer.BChemistry采用接触点样方式时,每个位点内的探针分布不均匀、受点样针设计与其他实验条件的影响,常使得边缘区域探针密度大于中心区域(即所谓“Coffee-ring”effect,“咖啡环”效应)[10].从今后大规模、批量化生产及应用前景的角度考虑,利用高度自动化技术平台、批量化原位合成基因芯片是重要的发展方向.目前在国际上,已经开发了多种DNA微阵列原位合成方法.例如,Fodor等研究开发了光导原位合成法[11~13];IBM公司研究组研究开发了光敏抗蚀合成法[14];Southern研究小组研究开发了微流体通道在片合成法[15~18];美国加州IcyePharmaceuticals公司和Protogen公司研究开发了原位喷印合成法[19,20];Houston大学的Gao等提出的光致酸脱保护DNA微阵列原位合成法[21];Singh-Gasson等提出的虚拟掩模光导向合成法[22];Whiteside研究组等利用微接触印刷技术[23~25]和东南大学生物电子学国家重点实验室等研究组提出的分子印章法[26~30].这些芯片制备方法各有特点,但普遍都存在着成本较高、工艺过程复杂的缺陷,有的甚至需要特殊的专利试剂.例如,美国Affymetrix公司拥有的光脱保护原位合成制备专利技术不仅需要特有的光脱保护试剂,而且必须针对不同的用户制作特定的光掩模,因而成本较高,不适合小批量生产需求.因此,发展和开发快捷、成本低廉的DNA阵列原位合成技术具有重要意义.最近,在总结前人工作的基础上,湖南工业大学和东南大学研究者提出了一种具有自主知识产权的基于活版印刷原理的基因芯片原位合成制备新技术[31],并对该方法进行了大量的原理实验和基础研究.该制备技术将成熟的高效亚磷酸酰胺固相合成方法、现在广泛应用的DNA合成试剂与中国古代活版印刷技术相结合,将具有微纳米通道的真空纤维管按照基因芯片探针阵列各层的碱基排列设计组装成一系列印刷模版,利用纤维管的毛细效应源源不断吸附单体溶液,就象活版印刷书刊一样精确定位循环压印来实现DNA探针的原位合成.其显著特点为:完全避免了现有原位合成方法中烦琐而昂贵的掩模制备过程及点样法中昂贵的探针修饰或标记成本,针对不同用户需求只需重新排列印刷模版即可,如果把现有基于掩模制作技术的原位合成方法比做刻版印刷的话,本方法则有活版印刷的特点;所耗单体试剂少,成本低;而毛细效应带来的类似于液相的压印反应环境,则赋予了合成探针极高的偶联效率和探针位点的信号均匀性,确保了获取生物信息的准确性;易实现自动控制和精确定位,合成速度快,在较短时间内就可快速印刷合成出探针分布均匀的大批量基因芯片;同时还可应用于多肽或其他生物大分子微阵列的合成.1实验部分1.1仪器、材料与试剂PCR-MATEMODEL391DNA合成仪(美国Biosystems公司),无水无氧操作系统(MECABOX94-2S1,瑞士MECAPLEX公司),基因芯片荧光扫描仪(ScanarrayLiteMicroarrayAnalysisSystem,PackardBiochipTechnologies).99.999%氩气和7%H2+93%Ar的混合气(上海比西欧特种气体有限公司).聚四氟乙烯反应池10个(南京市橡塑制品厂加工制造),微孔聚酯纤维管(南京金技有限责任公司),帆船牌国产载玻片(25.0mm×75.0mm).DNA合成单体A,G,C,T(北京奥科生物有限责任公司);荧光靶序列5′-AAAAGTTTGAGAGCT-TAMRA-3′(上海生工生物技术有限责任公司),用2×PBS溶液稀释至100nmol/L;氧化剂:(碘/水/吡啶/四氢呋喃=3%/2%/20%/75%).所有试剂除乙腈为高效液相色谱纯、异丁腈为色谱纯外,其余皆为分析纯,从当地经销商购买.1.2玻璃基片上手臂分子的组装在实验中我们采用了连接两次戊二醛和乙二胺来延长手臂分子.首先将玻璃片基在硫酸洗液(浓硫酸的重铬酸钾饱和溶液)中浸泡24小时,分别用自来水、去离子水洗涤,干燥;然后将载玻片在硅烷化试剂中(95%乙醇和3-氨基丙基三乙氧硅烷以体积比为49︰1配制而成)浸泡10min;硅烷化后的玻片,用双蒸水充分清洗,然后立置,用洗耳球由上向下吹干载玻片;将载玻片置于干燥箱内,110℃烘30min,然后用乙醇清洗,吹干;用5%戊二醛的0.1mol/LPB(磷酸纳缓冲液,pH=7.4)溶液浸泡并在摇床上振荡2小时,然后用乙醇清洗,吹干;接着用10%的乙二胺水溶液浸泡并在摇床上振荡2小时,然后用乙醇清洗,第6期汤建新等:活版印刷技术原位合成DNA微阵列495www.scichina.com吹干;用5%戊二醛的0.1mol/LPB(磷酸纳缓冲液,pH=7.4)溶液浸泡并在摇床上振荡2小时,然后用乙醇清洗,吹干;再用10%的乙二胺水溶液浸泡并在摇床上振荡2小时,并用乙醇清洗,然后立置,用洗耳球由上向下吹干载玻片.最后用自配的还原试剂(硼氢化钠0.07g,10×PBS2mL,乙醇6mL,蒸馏水17mL)浸泡还原15分钟.硅烷化与手臂分子连接各步反应式如下:1.3寡核苷酸微阵列的合成活版印刷法寡核苷酸微阵列的原位合成是遵循亚磷酸酰胺固相合成法,其合成路径由偶联、封闭、氧化和脱dimethoxytrityl(DMT)保护基团四步反应构成一个合成循环[32,33].活版印刷法寡核苷酸的合成原理为:将亚磷酸酰胺第一步化学反应,即偶联反应,由活版偶联压印来完成,压印偶联反应是在手套箱中进行的.封闭反应对于寡核苷酸在片合成可以舍弃[28],活版印刷法寡核苷酸微阵列合成属于在片合成,不存在后续纯化过程,因此,在研究中也省略封闭反应.氧化和脱保护反应在通风橱中进行.在压印偶联反应中,依靠聚四氟乙烯反应槽精确定位,模版纤维管凸出尖端与玻璃载片接触,从而使核苷酸单体与玻璃载片上的氨基发生偶联反应.偶联反应完成后,再进行氧化和脱DMT反应,这样便完成了一个循环;依次再完成其余多个合成循环.合成条件见表1.手套箱的环境为O2≤1.0×10−5%,H2O≤1.0×10−5%(均为体积含量).寡核苷酸微阵列压印合成可以是手动合成,也可以是自动合成(自动合成仪正在研究开发中),本文的原理实验结果是用手动合成实现的.合成步骤见图1.1.4杂交与检测载玻片片基上合成的寡核苷酸产物按照Polushin等[34]报道的方法脱保护,然后用去离子水洗净,吹干.表1寡核苷酸原位合成条件合成步骤反应试剂或溶剂反应时间/s清洗乙腈30偶联(0.1mol/L单体+0.5mol/L四唑)乙腈、异丁腈溶液100清洗乙腈30氧化0.1mol/L碘/水/吡啶/四氢呋喃溶液80清洗乙腈30脱DMT3%三氯乙酸二氯甲烷溶液80清洗乙腈30496中国科学B辑化学第36卷SCIENCEINCHINASer.BChemistry图1活版印刷法制备寡核苷酸微阵列流程示意在探针合成区域分别点上稀释到100nmol/L的标有荧光的靶序列杂交液,并盖上排斥硅烷疏水盖玻片,应注意载玻片与盖玻片间不能留有气泡,最后盖上杂交盒盖.把杂交盒置于42℃的数显恒温水浴锅中先杂交1h,接着将温度降至37℃杂交2~3h,34℃再杂交2h,室温再杂交1h.杂交完毕,将玻璃载片置于0.1%SDS的2×SSC中在摇床上振荡清洗10分钟,然后再用0.1%SDS的0.1×SSC溶液在摇床上振荡洗涤10分钟,最后用二次蒸馏水快速冲洗玻璃载片,用洗耳球吹干(整个操作应在避光下进行).用荧光扫描仪和微软荧光分析系统进行分析处理.2结果与讨论2.1活版印刷法DNA合成原理寡核苷酸的固相合成方法主要有氢磷酸酯法、磷酸三酯法和亚磷酸酰胺法三种,其中亚磷酸酰胺方法由于其高效和快速的偶联以及起始物质的稳定性而最适合活版印刷法DNA芯片制备.活版印刷法的原理是将具有微纳米毛细通道的微米级真空纤维管或微颗粒作为印刷“活字”材料,构成一系列组合印刷模版,并将反应试剂储存于这些组合印刷模版下,依靠毛细效应单体试剂能源源不断地传输到纤维管或微颗粒压印尖端,这样保证了在压印合成时压印尖端富含单体试剂,并能与基片充分接触而又不向周围扩散.每一张模版对应于一种合成单体试剂,应用组合化学原理循序压印到基片上进行化学偶联,最终得到所需的化合物微阵列.对于DNA微阵列来说,由于只有4种单体,每一层最多只需组合4张印刷模版,这些微小纤维载体材料就象古代活版印刷中的“活字”一样,经过乙腈溶液浸泡、漂洗就可以重复使用(仅局限于同一单体间使用),针对不同的用户要求和不同的芯片设计,只需要用机械手或手工重新排列组合印刷模版就可实现芯片快速印刷制备.图2所示简要说明了其合成原理(图中:寡核苷酸所含碱基个数为8,而所合成的寡核苷酸微阵列点阵数为16,只是为了简单明了地说明原理).2.2手动合成装置的设计手动活版印刷法寡核苷酸微阵列的原位合成是在10个如图2示的聚四氟乙烯合成装置中进行的.将第6期汤建新等:活版印刷技术原位合成DNA微阵列497www.scichina.com图2活版印刷压印化学反应原理100cm