基因治疗

1九、基因治疗Genetherapy2（一）、基因治疗的发展简史、概念及背景（二）、基因治疗的基因导入系统（三）、基因治疗的途径（四）、基因治疗的靶细胞研究（五）、基因治疗在单基因遗传病、肿瘤和心血管疾病治疗上的应用（六）、基因治疗面临的问题和挑战（七）、基因治疗的发展方向3（一）、基因治疗的发展简史、概念及背景4基因治疗的发展简史时间发生事件研究者1944DNA是转化物质Avery1953DNA双螺旋结构模型WatsonandCrick1963遗传密码的破译Brenner1979重组体DNA技术、基因转染MulliganandBerg1980临床地贫研究Cline1990第一个临床试验（ADA)基因BlaséandAnderson1992大量癌症临床试验美国等1993中国制定第一部基因治疗质控要点中国1997至今重组病毒的产业化及其技术改进美国5基因治疗的概念经典：针对遗传病某一基因缺陷，将外源基因导入体内予以矫正；现在：凡是在基因水平上进行操作而达到治疗疾病的所有疗法6上世纪九十年代初，一位因ADA(腺苷酸脱氨酶)基因缺陷导致严重免疫缺损的四岁女孩，由美国国立卫生研究院用ADA基因治疗，取得疗效。“基因治疗”研究热从此波及全世界，起而效颦，为保障人类健康展现了美好的前景。7截止到2012年1月，基因治疗试验的全球、国家分布：基因治疗的疾病类型：基因治疗试验的临床阶段：1989-2012年1月，每年全球被批准的临床数目：89101112131415世界第一个基因治疗药物在中国诞生人民网深圳2003年10月22日15：30急电正在这里召开的深圳市政府新闻发布会向世界公布了一项振奋人心的消息：“世界首个基因治疗药物在中国诞生”。深圳市赛百诺基因技术有限公司研制开发的抗癌新药——“重组人p53腺病毒注射液”（商品名“今又生”），10月16日获得国家仪器药品监督管理局颁发的新药证书。这标志着我国在基因治疗药物研制和产业化方面已达世界领先水平，在国际竞争中抢占了先机。赛百诺公司负责人说，这种新药是拥有自主知识产权的广谱肿瘤基因治疗药品，可望明年一月正式上市。16根据靶细胞的类型分类：1、生殖细胞（germcell)基因治疗：2、体细胞（somaticcell)基因治疗根据基因转移的途径分类：1、invivo(活体直接转移或称一步法）2、exvivo(回体转移或称二步法）基因治疗的种类171、基因置换基因置换就是用正常的基因原位置换病变细胞内的致病基因，使细胞内的突变致病基因完全恢复正常状态，这种基因治疗方法最为理想。但这种方法是建立在同源重组技术基础上的，而目前同源重组虽然在技术上可行，但重组的效率很低，远没达到基因治疗要求的水平，在临床试验上就更无法实现了。基因治疗的策略182、基因修复基因修复是指将致病基因的突变碱基序列定点纠正，可用来治疗点突变导致的疾病。但由于纠错效率低的原因，实践中有相当的难度。193、基因增补将目的基因导入患者体内，其表达产物能补偿缺陷细胞的功能，可用于隐性遗传病的治疗。204、基因失活利用反义技术特异性封闭、抑制有害基因表达，可用于一些显性遗传病或肿瘤的基因治疗。21AndrewZ.Fire、CraigC.Mello221998年AndrewZ.Fire、CraigC.Mello等发现将很少量的双链RNA注入秀丽线虫体内，即可高效、特异地阻断/抑制与双链RNA同源的基因表达，其阻断/抑制率比纯化后的反义RNA技术高若干个数量级。双链RNA导入细胞后引起与该段RNA同源的mRNA发生特异性降解，进而使相应基因抑制的转录后基因沉默现象称RNA干扰。23双链RNA特异性核酸内切酶（dsRNA-specificendonuclease，Dicer）切割，形成21-23nt的双链短干扰RNA（short-interferenceRNA，siRNA），siRNA链为5’端磷酸化，3’端有二个碱基以非配对方式悬垂。24siRNA与由蛋白及酶类组成的RNA诱导沉默复合体（RNA-InducedSilencingComplex，RISC）结合后，由于RISC具有解旋酶活性，siRNA中的正义链和反义链解旋、解链。随后正义链被降解，而与RISC结合的反义链则按照碱基互补配对原则与靶mRNA中的同源序列结合，并由RISC发挥核酸内切酶作用，在距siRNA3’断11或12个碱基处切割靶mRNA。25倍增放大作用：siRNA一方面可引导RISC特异性切割靶mRNA；另一方面，siRNA还可作为引物与靶mRNA结合，在RNA依赖性RNA多聚酶（RNA-dependentRNApolymerase，RdRp）的作用下合成新的ds-RNA，再次经Dicer酶切割，形成新的siRNA，并作用于靶mRNA。26RNA干扰27微小RNA（microRNA）微小RNA（microRNA）大量存在人类基因组中的非编码RNA，能特异识别成熟mRNA的3’非翻译区，抑制mRNA的翻译。微小RNA（microRNA）1993年Lee等在对秀丽线虫进行突变体的遗传分析中首次发现的不能编码蛋白质，但能时序调控其胚胎后期发育基因表达的miRNA:Lin一4。282000年Reinhart等在线虫中发现了另一种重要的具有转录后调节作用的miRNA:let一7，后来发现了大量类似RNA，2001年起统一称为miRNA。29miRNA通常来源于一个大小约为1000bp的长链RNA初始转录产物(Pri一miRNA)，Pri一miRNA分子在细胞核中经过双链RNA特异性核酸酶Rnaselll一Drosha的作用形成70-100nt的具有茎环结构的RNA分子(pre一miRNA)。pre一miRNA在转运蛋白一5(Exportin一5)的作用下转运至胞质中，被另一个双链RNA特异性核酸酶Rnaselll一Dicer识别，进一步被切割成长约22nt的小分子RNA，即成熟的miRNA。成熟miRNA在RNA诱导的沉默复合物引导下，当与mRNA完美互补时，miRNA便指导mRNA特异性切割;当两者没有足够的互补性时，miRNA则抑制mRNA转录后翻译。30随着人类后基因组计划的进一步开展，占类基因组90%以上的非编码序列越来越引起科学家的关注，据计算推测，人类基因组可能存在1000多个miRNA基因，单个miRNA可调控200多个靶基因，约1/3的蛋白编码基因受miRNA调控。31miRNA是调节真核生物基因表达的天然反义寡核昔酸链。研究表明，miRNA参与了生命过程中一系列的重要过程，包括发育进程、造血过程、器官形成、细胞增殖和凋亡等，与许多疾病的发生、诊断、治疗和预后密切相关，miRNA也因而成为当前研究的新热点。325、免疫调节将抗原、抗体或细胞因子基因导入患者体内，改变其免疫状态，达到预防和治疗疾病的目的。如可将白细胞介素-2（IL-2）导入肿瘤病人体内，提高病人（IL-2）的水平，激活体内免疫系统的活性。33许多肿瘤都能表达一些肿瘤特异的抗原，将这些在正常机体内并不表达的肿瘤特异抗原的编码基因转入肿瘤内，制备成肿瘤DNA瘤苗，再导入患者体内，通过其在机体内的表达可以激发机体对编码抗原的免疫反应。如黑色素瘤相关抗原MAGE、在多种肿瘤中表达的癌胚抗原CEA、病毒基因产物HPV-E6、E7等。346、其他方法增加肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。如向肿瘤细胞导入单纯疱疹病毒胸苷激酶基因，然后给予病人无毒性核苷类似物GCV（甘昔洛韦，ganciclovir）的药物前体，由于只有含单纯疱疹病毒胸苷激酶基因的细胞才能将GCV转化成有毒的药物，因而肿瘤细胞被杀死，而对正常细胞影响不大。35由于基因治疗的人体试验引发了争论，为了规范这一新生事物，使其更好地为人类健康服务，但同时又在人类伦理学的接受范围内，1975年美国国立卫生研究院（NIH）召集和组织了重组DNA顾问委员会（RecombinantDNAAdvisoryCommittee,RAC）,制定了一系列有关重组DNA研究的法规，接着RAC又任命了一个人体基因治疗的分委员会（HumanGeneTherapySubcommittee）,并于1985年颁布了一个权威性的文件，称为“人体细胞基因治疗方案的设计和提请批准的注意要点”，该文件要点如下：基因治疗的守则361、什么病可以采用基因治疗？即被治疗的疾病是否严重到必须要用这种全新和从未尝试过的疗法？试图增加一个人的能力而不是治疗疾病，将立即被否决。372、该病目前是否有其他治疗方法？要求基因治疗必须用于目前尚无满意疗法的疾病，在其他所有因素均等同的情况下，基因治疗应较其他疗法更有效。383、根据已有的实验室和临床研究，基因治疗对于患者及其子女和接触者的安全性如何估计？即基因治疗的安全性必须有保证。394、根据已有的实验室和临床研究，基因治疗的疗效预计将如何？即基因治疗的有效性在进行人体试验前要有足够的动物试验证据。405、如果满意地回答了上述4个问题，那么如何公正地选择受试者？6、如果上述5个问题都有满意的答案，那么医生将如何把基因治疗的各种情况恰当正确地告知患者，以及他们将如何表达同意和不同意？即要保证患者的知情同意权。417、在满意地回答了上述所有问题后，将采取什么步骤来保护接受基因治疗患者的隐私权？临床申请的基因治疗方案经过审议，如果不符合这些条件，则禁止实施。（二）、基因治疗的基因导入系统基因导入系统（genedeliverysystem）是基因治疗的核心技术，可分为病毒载体系统和非病毒载体系统。421.病毒载体系统用于基因治疗的病毒载体应具备以下基本条件：1).携带外源基因并能包装成病毒颗粒；2).介导外源基因的转移和表达；3).对机体不致病。43大多数野生型病毒对机体都具有致病性。因此需要对其进行改造后才能用于人体。原则上，各种类型的病毒都能被改造成病毒载体。但是由于病毒的多样性及与机体复杂的依存关系，人们至今对许多病毒的生活周期、分子生物学、与疾病发生及发展的关系等的认识还很不全面,从而限制了许多病毒发展成为具有实用性的载体。近20年来，只有少数几种病毒如反转录病毒（包括HIV病毒）、腺病毒、腺病毒伴随病毒、疱疹病毒（包括单纯疱疹病毒、痘苗病毒及EB病毒）等被成功地改造成为基因转移载体并开展了不同程度的应用。44病毒载体产生的原理病毒载体的产生建立在对病毒的生活周期和分子生物学认识的基础之上。研究病毒载体首先要对病毒的基因组结构和功能有充分的了解，最好能获得病毒基因组全序列信息。病毒基因组可分为编码区和非编码区。编码区基因产生病毒的结构蛋白和非结构蛋白；根据其对病毒感染性复制的影响，又可分为必需基因和非必需基因。非编码区中含有病毒进行复制和包装等功能所必需的顺式作用元件。45各种野生型病毒颗粒都具有一定的包装容量，即对所包装的病毒基因组的长度有一定的限制。一般来说，病毒包装容量不超过自身基因组大小的105～110％。基因重组技术的发展使病毒载体的产生成为可能。最简单的做法是，将适当长度的外源DNA插入病毒基因组的非必需区，包装成重组病毒颗粒。46然而，这样的重组病毒作为基因转移载体有许多缺点。首先，许多野生型病毒通过在细胞中产毒性复制而导致细胞裂解死亡；或带有病毒癌基因而使细胞发生转化。因此必须经过改造使其成为复制缺陷性病毒并且删除致癌基因后才能用于基因治疗。47其次，插入外源DNA的长度受到很大限制，尤其对于基因组本身较小的病毒如腺病毒相关病毒（AAV，4.7kb）、反转录病毒（8～10kb）、腺病毒（36kb），如果不去除病毒基因，可供外源DNA插入的容量就十分小。因此，必须删除更多的病毒基因以腾出位置插入较大的外源DNA。为了增加病毒载体插入外源DNA的容量，除了可以删除病毒的非必需基因外，还可以进一步删去部分或全部必需基因，这些必需基因的功能由辅助病毒或包装细胞系反式提供。48LTRgagpolenvφLTR长末端重