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模块七基因工程药物检测一、检验岗位药物检验工二、工作目标掌握基因工程药物的检测原则和方法。三、操作准备（一）职业形象：药品检验人员，应从思想上明确不合格药品的危害，不得有丝毫马虎。操作要严格按无菌操作进行。（二）职场环境：无菌室清洁整齐，定期检查无菌室空气细菌情况（三）参考资料：《中国生物制品规程》、《中国药品检验标准操作规范》、《中国药典》模块七基因工程药物检测四、检定原则和方法（一）检定原则依据：《中国生物制品规程》规程对每个制品的检验项目、检验方法和质量指标都有明确的规定，质检人员必须严格按照规程对药物进行检定，以保证人民用药安全、有效。基因工程药物的检定随生产过程需要进行原液检定、半成品检定和成品检定。检定项目可分为理化检定、安全检定和效力检定三个方面。模块七基因工程药物检测（二）检定方法1、理化检定（1）外观检查：通过特定的人工光源检测药物的外观，其颜色、状态和加入蒸馏水后的澄清度应符该药物的规程要求。（2）化学检定：除水分检查项外，按规定加入一定量灭菌注射用水溶解后进行。①pH值测定：pH值测定方法（电位法），玻璃电极酸度计测定用两种标准缓冲溶液校正或核对，误差不得超过0.05。pH测定仪由传感器和二次表两部分组成。可配三复合或两复合电极，以满足各种使用场所。配上纯水和超纯水电极，可适用于电导率小于3μs/cm的水质（如化学补给水、饱和蒸气、凝结水等）的pH值测量。②水分含量确定：用卡尔·费休水分测定法，一般水分含量不得高于3.0%。其原理是仪器的电解池中的卡氏试剂达到平衡时注入含水的样品，水参与碘、二氧化硫的氧化还原反应，在吡啶和甲醇存在的情况下，生成氢碘酸吡啶和甲基硫酸吡啶，消耗了的碘在阳极电解产生，从而使氧化还原反应不断进行，直至水分全部耗尽为止，依据法拉第电解定律，电解产生碘是同电解时耗用的电量成正比例关系的。模块七基因工程药物检测③蛋白质含量测定：微量法即Folin---酚法测定蛋白质含量原理：磷钼酸和磷钨酸在碱性条件下，易被酚类化合物还原而呈蓝色反应．蛋白质中含有代酚基的酪氨酸，故有此反应．Folin---酚法的灵敏度是双缩脲法的100倍．④纯度检查：非还原型SDS-PAGE法：经扫描仪扫描纯度应符合要求。高效液相色谱法：波长280nm检测，应呈一个吸收峰，或主峰峰面积不低于总峰面积的百分比纯度规定。模块七基因工程药物检测⑤等电点测定：等点聚焦电泳法蛋白质分子是典型的两性电解质分子。它在大于其等电点的pH环境中解离成带负电荷的阴离子，向电场的正极泳动，在小于其等电点的pH环境中解离成带正由荷的阳离子，向电场的负极泳动。这种泳动只有在等于其等电点的pH环境中，即蛋白质所带的净电荷为零时才能停止。如果在一个有pH梯度的环境中，对各种不同等电点的蛋白质混合样品进行电泳，则在电场作用下，不管这些蛋白质分子的原始分布如何，各种蛋白质分子将按照它们各自的等电点大小在pH梯度中相对应的位置处进行聚焦，经过一定时间的电泳以后，不同等电点的蛋白质分子便分别聚焦于不同的位置。这种按等电点的大小，生物分子在pH梯度的某一相应位置上进行聚焦的行为就称为“等电聚焦”。等电聚焦的特点就在于它利用了一种称为两性电解质载体的物质在电场中构成连续的pH梯度，使蛋白质或其他具有两性电解质性质的样品进行聚焦，从而达到分离、测定和鉴定的目的。模块七基因工程药物检测⑥分子量测定：还原型SDS-PAGE法模块七基因工程药物检测电泳槽SDS-PAGE，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基硫酸钠），SDS会与变性的多肽，并使蛋白带负电荷，由于多肽结合SDS的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关，因此SDS多肽复合物在丙稀酰胺凝胶电泳中的迁移率只与多肽的大小有关，在达到饱和的状态下，每克多肽可与1.4g去污剂结合。蛋白上样缓冲液(SDS-PAGEloadingbuffer是一种以溴酚蓝为染料，5倍浓缩的SDS-PAGE凝胶电上样缓冲液,用于常规的SDS-PAGE蛋白电泳样品上样。模块七基因工程药物检测⑦外源性DNA残留量测定：固相斑点杂交法或其他敏感方法测定⑧宿主菌蛋白残留量测定：酶联免疫法⑨残余抗生素活性：氨苄青霉素残留量测定法⑩紫外光谱扫描：基因工程药物一般在277-280nm呈特征性最大吸收⑾肽图分析：重组制品肽图分析法分为酶切肽图分析法和化学裂解肽图分析法。⑿N末端氨基酸序列测定：氨基酸序列分析仪测定。⒀鉴别试验：分斑点免疫法和免疫印迹法。鉴别试验应为阳性。模块七基因工程药物检测模块七基因工程药物检测氨基酸序列分析仪紫外光谱仪模块七基因工程药物检测2、安全检定①无菌试验：A项细菌及真菌检查法。结果判断：无杂菌生长判为合格；发现杂菌生长可复试，复试样品应加倍。复试无杂菌生长判为合格，若仍有杂菌生长判为不合格。②细菌内毒素检定：鲎（hòu）试剂与细菌内毒素产生凝结反应的原理。鲎试剂是由海洋生物鲎的血液变形细胞溶解物制成的无菌冷冻干燥品，含有能被微量细菌内毒素和真菌葡聚糖激活的凝固酶原，凝固蛋白原，能够准确、快速地定性或定量检测样品中是否含有细菌内毒素和（1,3）-β-葡聚糖激。目前，鲎试剂广泛用于制药、临床以及科研等领域，用于细菌内毒素和真菌葡聚糖检测。将试管从水浴中轻轻取出，缓缓倒转180°时，管内凝胶不变形，不从管壁脱落者为阳性，凝胶不能保持完整并从管壁滑落者为阴性。③异常毒性检测：小鼠试验项进行。④热原质检测：将一定剂量的供试品静脉注射家兔，在规定期间内观察家兔体内体温升高情况。模块七基因工程药物检测模块七基因工程药物检测3、效力检测①效价检测：效价：指某一物质引起生物反应的功效单位,可用理化方法检测,也可用生物检测方法测定。生物制品活性（数量）高低的标志，通常采用生物学方法测定。用国家标准品校准确定校价，除个别品种外，一般校价应为标示量的80%—150%。②比活性测定：按规程要求测定，应不低于各品种规定标准。比活性：每个质量单位所含活性单位的数目。如每毫克蛋白质所含酶单位数。标记分子中标记放射性的相对强度或非放射性标记物(如酶标记物)相对活性的表示方法。一般以单位质量所含放射性核素量(如所测得的放射性记数率)或酶的活性单位(如U)等表示。模块七基因工程药物检测（三）、检定注意事项：①所用试剂均需分析纯②卡尔费休水分测定法：Fischer试剂很不稳定，配置后应放置一周后再使用，所有操作在干燥环境中进行③纯度测定：用SDS-PAGE法加样量应不低于5μg（银染法）或10μg（考马斯亮蓝R-250染色）。④分子量测定：除品种另有规定外，加样量应不低于1μg。⑤肽图分析：至少每半年检查一次。⑥N末端氨基酸序列测定：至少每年检查一次。⑦无菌试验：无菌试验用的培养基应先检查其本身的灵敏度，否者可能造成假阴性。⑧细菌内毒素含量测定⑨热原质试验模块七基因工程药物检测五、基础知识1、基因工程药物：将生物体内生理活性物质的基因，利用重组DNA技术加以改造，然后使其在细菌、酵母、动物细胞中大量表达的新型药物。2、基因工程药物的分类主要包括重组蛋白多肽药物和核酸类药物（1）重组蛋白多肽药物：重组细胞因子、重组人生长激素、重组人胰岛素、重组溶血酸药物、基因工程血液代用品、重组可溶性受体等。重组人胰岛素为重组DNA技术生产的由51个氨基酸残基组成的蛋白质，宿主细胞为大肠杆菌。按干燥品计算，每1mg含重组人胰岛素不得少于27.5单位。重组人胰岛素中残余宿主DNA和宿主细胞蛋白质为与生产过程相关的、潜在的特异性杂质，必须在生产过程中严格控制，其限度应符合有关规定。人胰岛素的生产方法:A.化学合成法制人胰岛素根据人胰岛素A链和B链的序列，由单个氨基酸从头合成。技术可行，但其生产成本奇高。B.化学转型法制人胰岛素猪胰岛素与人胰岛素只在B链的C末端有一个氨基酸的差异，猪的为Ala，人的为Thr，可将猪胰岛素在体外酶促转化为人胰岛素。但工艺复杂，产品的价格不菲。C.基因工程法制人胰岛素1982年，美国ElyLiLi公司首先使用重组大肠杆菌生产人胰岛素，成为世界上第一个上市的基因工程药物。由基因工程菌合成的重组人胰岛素在体外胰岛素受体结合性能、降血糖作用、血浆药代动力学等指标上均与天然胰岛素没有任何区别。模块七基因工程药物检测（2）核酸药物①反义核酸药物反义核酸是指能与特定mRNA精确互补、特异阻断其翻译的RNA或DNA分子。利用反义核酸特异地封闭某些基因表达，使之低表达或不表达，这种技术即为反义核酸技术。它包括反义RNA、反义DNA和核酶三大技术。反义核酶作为一种基因下向调节作用因子，在抑制一些有害基因的表达和失控基因的过度表达上发挥着重要作用。反义核酸药物是能根据碱基互补原则抑制、封闭或破坏靶基因，从而抑制一些有害基因的表达和失控基因的过度表达的反义核酸。模块七基因工程药物检测②非反义核酸药物分为免疫调节剂CpG、DNA和诱饵核酸等CpG表示核苷酸对，其中G在DNA链中紧随C后。CpG对很少出现在人类基因中。然而，在许多基因的启动子或转录起始位点区域周围，甲基化经常被抑制。这些区域包含浓度相对较高的CpG对，与染色体一起称作CpG岛，其长度通常在几百到几千核苷酸的长度内变化。CpG寡核苷酸是一种高效低毒的免疫佐剂,在许多疾病的基因治疗中具有广阔的应用价值。③基因疫苗即一些病原体基因，将其导入机体后刺激机体产生特异的免疫力，以抵抗这些病原体的侵袭。将DNA表达质粒注入体内，通过表达相应编码蛋白而诱导机体产生特异性免疫应答。模块七基因工程药物检测④基因药物基因工程药物是先确定对某种疾病有预防和治疗作用的蛋白质，然后将控制该蛋白质合成过程的基因取出来，经过一系列基因操作，最后将该基因放入可以大量生产的受体细胞中去，这些受体细胞包括细菌、酵母菌、动物或动物细胞、植物或植物细胞，在受体细胞不断繁殖过程中，大规模生产具有预防和治疗这些疾病的蛋白质，即基因疫苗或药物。在医学和兽医学中应用正逐步推广。模块七基因工程药物检测3、基因工程药物的优点①可以克服利用天然生物材料生产药物的潜在危险②可以大规模生产满足临床需要③利用基因工程技术可以改造内源生理活性物质，进一步提高其生物活性。④可以降低药物成本，让更多的病人受益。⑤可以生产体内不存在的生物大分子，扩大药物来源。模块七基因工程药物检测模块七基因工程药物检测以干扰素为例：当人或动物受到某种病毒感染时，体内会产生一种物质，它会阻止或干扰人体再次受到病毒感染，故人们把此种物质称为干扰素（Interfero,简称IFN），是1957年英国科学家多萨克斯和林德曼在研究流感病毒干扰现象时发现的。干扰素具有广谱抗病毒的效能，是一种治疗乙肝的有效药物，国际上批准治疗丙型病毒性肝炎的药物只有它。但是，通常情况下人体内干扰素基因处于“睡眠”状态，因而血中一般测不到干扰素。只有在发生病毒感染或受到干扰素诱导物的诱导时，人体内的干扰素基因才会“苏醒”，开始产生干扰素，但其数量微乎其微。即使经过诱导，从人血中提取1mg干扰素，需要人血8000ml，其成本高得惊人。据计算：要获取1磅（453g）纯干扰素，其成本高达200亿美元。使大多数病人没有使用干扰素的能力。1980年后，干扰素与乙肝疫苗一样，采用基因工程进行生产，其基本原理及操作流程与乙肝疫苗十分类似。现在要获取1磅（453g）纯干扰素，其成本不到1亿美元。模块七基因工程药物检测（二）常见基因工程药物介绍1、重组人干扰素（IFN）系列：干扰素是一类具有抗病毒、抑制细胞增值和免疫调节等生物学活性的细胞因子。2、重组白细胞介素(IL)系列：白细胞介素是一类免疫调节因子。3、重组集落刺激因子（CSF）系列：集落刺激因子是一类刺激造血细胞集落形成的生长因子。4、重组促红细胞生成素（EPO）：促红细胞生成素是促进红细胞系列的增殖、分化和成熟的主要激素。5、重组碱性成纤维细胞因子（bFGF）：成纤维细胞因子是广谱的有丝分裂原，是形态发生和分化的诱导因子。6、重组生长激素（hGH）：生长激素是由垂体前叶分泌的刺激机体线性生长的激素。7、基因工程胰岛素（insulin）：胰岛素具有非常广