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Dkk1抑制经典Wnt信号通路的分子机制的研究StudyoftheMolecularMechanismofDkk1-MediatedInhibitionofCanonicalWntPathway(申请清华大学理学硕士学位论文)培养单位:生物科学与技术系学科:生物学研究生:蔡恬恬指导教师:吴畏教授二00八年五月关于学位论文使用授权的说明本人完全了解清华大学有关保留、使用学位论文的规定，即清华大学拥有在著作权法规定范围内学位论文的使用权，其中包指:(])已获学位的研究生必须按学校规定提交学位论文，学校可以采用影印、缩印或其他复制手段保存研究生上交的学位论文;(2)为教学和科研目的，学校可以将公开的学位论文作为资料在图书馆、资料室等场所供校内师生阅读，或在校园网上供校内师生浏览部分内町，谷。本人保证遵守上述规定。(保密的论文在解密后遵守此规定)作者签名2日JtI1:导师签名2日期摘要Wnt信号通路是一条非白保司的信号转导途径，在ì{F:多生理过程中部发挥了重要的作用。DkkCDickkopf)是Wnt信号通路中重要的拮抗分于之一，能够特异地抑制经典Wnt信号通路。现今有两种模型分别解释Dkk抑制经典Wnt信号的分子机制在第一种棋型巾，一些研究者认为Dkkl主要通过在细胞外与配体Wnt竞争受体LRP6从而抑制Wnt信号，在第二种模型中，另一些研究者们则认为在Kremen存在的情况下，Dkkl通过诱导形成DkkI-LRP6-Kremen三元复合物，并迅速诱导这个三元复合物的内吞从而发拓抑制功能。对于这两种模型一直存在争论。本课题对两种模型分别进行了研究，最终证明两种极型都在Dkkl抑制经g~Wnt信号道路过程中发挥了作用，并且两者之间不存在矛盾。我们首次使用半定211免疫染色的方法检测到Dkkl可以特异地抑制Wnt-Frizzled-LRP6三元复合体的形成。通过对于氏期效应模型中内吞的分子机制的研究，我们发现Kremen的胞顶端不仅对于DkkI-LRP6-Kremen三元复合物的内吞是必衍的，它在辅助Dkkl抑1!l~经典Wnt信号的过程中也发挥了重要作用。并且我们初步确定DkkI-LRP6-Kremen三元复合体是通过依赖Clathrin内吞途径进行内吞，且AP-2复合体可能是识别此三元复合物的接头蛋白。同时，在实验l:j:1我们坯发现Kremen不仅可以在不依赖Dkk的情况下与LRP6相互作用，全长的Kremen还可以辅助LRP6转运上!快，这表明Kremen可能在辅助Dkk抑制经典Wnt信号通路的作用外还存在看其它功能。关键词。Wnt信号迎路DickkopfKremen内吞AbstractWntsignalingpathwayisaconservativesignalingpathway,playingveryimportantrolesindiversephysiologicalprocesses.DkkisoneoftheimportantantagonistsinWntsignalingpathwayandwasfoundtospecifïcallyìnhibitcanonicalWntpathway.Twomodelshavebeenproposedtoexpla川molecularmechanismofDkk'sinhibitionroleincanonicalWntpathway:inthefirstmodel,DkklcompetesforbindingofWntco-receptorLRP6;inthesecondmodel,Dkk1canformaternarycomplexwithLRP6andKremenatthepresenceofKremen,andtriggerstheendocytosisofthisternarycomplexquickly.ThecontroversiesbetweenthesetwomodelsexistduringtheseyearsInthisproject,westudiedthesetwomodelsrespectively.OurresultssuggestthatboththesetwomodelsfunctioninDkk'sinhibitionroleandthereisnoconf1ictbetweenthem.Usingsemi-quantityimmuno-stainingassay,wefïrstlydetectedthatDkkIcaninhibittheformationofWnt-Frizzled-LRP6ternarycomplex.10thestudyofthemolecularmechanismofendocytosisproposedinthelong-termeffect,wefoundthattheintracellulardomainofKremenisrequiredfortheendocytosisofDkkl-LRP6-Krementernarycomplex,anditalsoplaysimportantrolesinDkk'sinhibitionroleinWntcanonicalpathwayOurresultsalsosuggestedthatthisendocytosisisClathrin-dependentandAP-2mightbetheadaptorproteinthatrecognizestheternarycomplexMoreover,wefoundthatKremencaninteractwithLRP6independentofDkk,andfull-IengthKremencanevenpromotethemembranelocalizationofLRP6,indicatingthatKremenmightplayotherrolesbesidesassistingDkktoinhibitcanonical飞WntpathwayKeywords:WntsignalingpathwayDickkopfKremenendocytosis11目录第l章引言l1.1Wnt信号通路l1.1.1经典Wnt信号通路l1.1.2Wnt受体2川2.1Frizzled......................................................................................................21.1.2.2Arrow/LRP5/LRP6....................................................................................31.1.3Wnt拮抗分子Dickkopf................................................................................41.1.4单跨脱受体Kremen.....................................................................................51.2受体的主要内吞途径71.2.1依赖Clathr;n((.J内吞途径71.2.1.1参与依赖Clathrin内吞途径的接头蛋白91.2.1.2货物萄白七分委信乓的识l:II................................................................101.2.1.3受体内吞与信号转导之间的紧密联系111.2.2依赖Caveolin的内吞途径121.2.2.1Caveolin家族蛋白121.2.2.2Cavco\ae结构及CaveoJae的内吞131.2.3Wnt信号通路中的受体内吞141.3课题概述15第2章实验材料、试剂和仪器172.1实验材料172.2实验试剂172.3实验仪器18第3章主要实验方法191113川l重组j质且粒的构主建tt..............................................................................................1993.2荧光索酶检扭测ti实验lω93.3细!胞血兔疫染包2却03.4DkklιI-F凹la唔E和Wnt凶8-NFz53.5纠卸细UJ胞血j脱E贝z表田蛋白结合实验2223.6兔疫共沉淀2刀33.7生物絮标记细)胞胆股表面蛋臼2μ43.8酵母双杂交检测蛋自相互作用2μ4第4章实验结果及讨论2罚64.1Dkkl能够竞争性抑制Wnt-NFz5础合蛋白与交体LRP6的结合264.1.1XWnt8-NhFz5融合蛋白的73集与定2，1.....................................................264.1.2细胞膜表面蛋白半定盐染色方法的建立294.1.3Wnt-NFz融合蛋臼能与细胞膜表面的LRP6结合.IlDkkl能够竞弯'性抑制Wnt-NFz融合蛋白与受体LRP6的结合314.2Kremen2的胞内瑞对于Dkk1-LRP6-Kremen三元复合物的内吞是必i币的344.2.1DkkI-LRP6-Kremen三元复合物的内吞344.2.2Kremen2的胞内端对于三元复合物的内吞是必锚的364.2.3研究三元复合物内吞机制的初步尝试404.2.4寻找介导三元复合物内吞的接头蛋白的尝试424.3Kremen2((.J胞内端在Dkkl介导的抑制经典Wnt信号过程中发挥作用434.4与Krm2胞内端相互作用蛋白的筛选494.4.1使用酵母双杂交技术筛选与Krm2胞内端相互作用的蛋白494.4.2部分候选蛋臼的再检验514.4.2.1PIST与Krm2相互作用的再检验514.4.2.2EndophilinB1与Krm2相互作用的再检验53第5章结论55IV参考文献57致谢与声明65个人简历、在学期间发袤的学术论文及研究成果66V第1章引言1.1Wnt信号通路Wnt信号迎路是一条非常保苛的信号转导途径，参与了胚胎形成的许多发育过程，并且在维持成体组织的动态平衡中起到了重要作用ILI。最近的研究结果思示.Wnt信号还参与调节干细胞的分化和l自我更新1210Wnt蛋白家族是系列胞外生l是因子，官们能够通过激活细胞内的不同信号级联放大反应，进而íjl;j控或决定发育过程中细胞的命运、分化、迁移、极性以及增殖等131。目前，Wnl信号通路主要分为三条途径(1)Wntlß-catenin信号通路，通市称为经典Wnt通路，主要通过稳定细胞内的ß-catenin.进而促进βcatenm进入细胞核、调控下iìfí祀基因的表达(2)WntlPCP(PlanarCellPolarity)信号通路，主要通过小G蛋白RhoA和Cdc42等激活JNK(junN-terminalKinasc)，进而调节不同种类细胞的极性(3)WntlCa2+{言号通路，主要通过调节G蛋臼激活胞质中多种对Ca2+敏感的邸，包括PLCCphosphoJipaseC),PKCCproteinkinaseC)和CamKII(calcium-calrnodulindependentkinaseII)等，进而调节细胞内Ca2+的释放[1.3.4)。1.1.1经典Wnt信号通路经典Wnt信号通路是最早被发现的Wnt信号途径，图1.1是经典Wnt信号通路的示意图.当处于未被激活的状态时，Axin.APC(AdcnomatousPûJypûsisColi)和GSK3ß(GlycogenSynthaseKinase-3ßl形成一个巨大的蛋白复合体磷酸化胞质巾的ß-caten肌被磷酸化的ß-catcnin进而被泛素化，最后被蛋白酶体降解。而当!但外的配体Wnt与细胞膜上的七跨膜受体