第五章食品中化学物质的一般毒性作用及评价

第四章食品中化学物质的一般毒性作用及评价食品安全教研室学习目的与要求•理解急性毒性和急性毒性试验的概念和目的、经典急性致死性毒性试验、急性毒性的分级、急性毒性试验的其他方法。•理解亚慢性毒性和慢性毒性试验的概念和目的、亚慢性和慢性毒性试验方法。•熟悉蓄积毒性、化学物质的蓄积作用、蓄积作用的研究方法。基本概念•化学毒物：在一定条件下，以较小剂量给予时，可与生物体相互作用，引起生物体功能或器质性损害的化学物质。•毒物与非毒物没有绝对的界限•毒性：外来化学物引起生物体损害的能力，毒物毒性的大小可通过所产生损害的性质和程度表现出来。•毒作用（毒效应）：•化学毒物按其化学性质可分为挥发性毒物，金属毒物，农药兽药残留，鼠药，有毒动植物，真菌毒素及其他化学污染物等。•一般毒性作用（基础毒性）：外来化学物在一定剂量，一定接触时间和接触方式下对试验动物产生的综合毒效应。根据接触毒物的时间长短又可分为急性毒性，亚慢性毒性和慢性毒性，相应的试验称急性毒性试验，亚慢性毒性试验和慢性毒性试验。•一般毒性试验的方法：一般毒性测试污染物理化特性了解毒性大小和特征了解在体内蓄积和耐受特性蓄积毒性试验确定阈和阈下剂量了解对机体毒作用靶点和指标急性毒性试验亚急性毒性试验亚慢性毒性试验慢性毒性试验急性致死试验急性非致死试验研究化学毒物一般毒性作用的毒理学意义•毒理学工作的重要内容•安全性评价和危险度评定的基础•对防治化学毒物中毒、制定标准以及管理毒理学等有重要意义。§1急性毒性作用§2蓄积毒性§3亚慢性和慢性毒性作用§4局部毒性作用§1急性毒性作用•一、急性毒性和急性毒性试验概述•二、急性毒性试验及其评价•三、急性毒性分级急性毒性作用一、急性毒性和急性毒性试验概述•急性毒性的概念•急性毒性(acutetoxicity)是指机体(人或试验动物)一次接触或24小时内多次接触化学物后在短期(最长到14天)内所发生的毒性效应，包括一般行为、外观改变、大体形态变化以及死亡效应。急性毒性作用急性接触的含义•“一次接触”是含有时间因素的概念；•“多次接触”是指当化学物毒性很低，需要给予动物较大剂量时，可在24小时内分多次给予。•是毒理学研究中最基础的工作，是我们了解外源化学物对机体产生的急性毒性的根本依据。•1927年Trevan引入了半数致死量的概念来评价急性毒性，此后，该指标得到广泛的应用，并成为急性毒性的主要指标。化学物的急性毒性资料对于安全性评价及化学物管理方面非常重要。对急性毒性试验程序国际上和我国已有一些法规。急性毒性试验急性毒性试验观察内容•行为•外观改变•大体形态变化•死亡效应•LD50急性毒性试验的目的–①测试和求出化学毒物对一种或几种试验动物的致死量(以LD50表示)以及其它的急性毒性参数，了解急性毒作用强度。–②并通过观察动物中毒表现和死亡的情况，了解急性毒作用性质、可能的靶器官和致死原因，提供化学毒物的急性中毒资料、初步评价对人体产生损害的危险性。–③探求化学毒物急性毒性的剂量—反应关系与中毒特征。–④为亚慢性、慢性毒性作用试验的染毒剂量设计提供参考依据。–⑤研究化学毒物急性中毒的预防和急救治疗措施。–⑥为毒作用机制研究提供线索。急性毒性作用急性毒性参数代号或英文缩写试验终止效应毒性上限参数半数致死剂量或浓度最大致死剂量或浓度最小致死剂量或浓度LD50或LC50LD100或LC100MLD,LD50或MLC,LC50死亡死亡死亡可替代LD50的参数半数效应剂量或浓度最大耐受剂量或浓度或最大非致死剂量急性毒性估计值（LD50估计值或范围）ED50或EC50MTD,LD0或MTC,LC0MNLDATE非死亡不完全以死亡为终点动物用量少，不完全以死亡为终点毒性下限参数观察到有害作用的最低剂量未观察到有害作用的剂量LOAELNOAEL非死亡非死亡二、经典急性毒性试验及其评价外源化学物的种类不同，急性毒性试验的程序和要求有所不同。但总体原则和要点是相似的。受试物的保存和配制：•受试物的接受、分样、保管、称量、配制以及在此过程中的严格质量保证是急性毒性试验成功与否的关键。•急性毒性试验受试物配制的常用剂型水溶液、混悬液和油溶液。•所用的溶剂和助溶剂应该是基本无毒的，和受试物不起反应。(一)试验动物的选择–[原则]：•①急性毒性试验要求选择对化学毒物的代谢和毒效应表现与人的反应尽可能一致的试验动物。•②动物易于获得•③品系纯化•④价格较低和易于饲养等条件。急性毒性作用二、急性毒性试验•1．试验动物的种属和品系–最好用两种种属的动物–啮齿类:小鼠、大鼠、豚鼠或家兔–非啮齿类：狗或猴。–急性皮肤毒性试验可选用成年大鼠、豚鼠或家兔，优先考虑白色家兔。而急性吸入毒性试验和经口急性毒性试验则优先考虑大鼠。急性毒性作用二、急性毒性试验•⒉试验动物的年龄和体重：–急性试验动物不宜过老或过幼，通常要求选择刚成年动物进行试验，而且须是未曾交配和受孕的动物。例如：大鼠180～240g、小鼠18～25g、家兔2～2.5kg、豚鼠200～250g、狗10～15kg。同一批试验动物体重变异范围不应超过该批动物平均体重的20％。急性毒性作用二、急性毒性试验•3.试验动物的性别：–急性毒性试验的主要内容是求LD50，除特殊要求外，一般急性毒性试验对动物性别要求为雌雄各半。如果在预试验时发现化学毒物(如农药)对雌、雄动物毒效应的敏感性有明显差异，则应单独分别求出雌性与雄性动物各自的LD50。如果试验是为致畸试验作准备，也可仅作雌性动物的LD50测试。急性毒性作用二、急性毒性试验•4.动物数量与随机分组：–大、小鼠等小动物每组10只–狗等大动物每组6只–分组原则——随机化原则•5.禁食：–经消化道染毒时，要求试验前对动物禁食–大鼠、小鼠——隔夜进食；染毒后禁食4h–大动物——每日上午喂食前染毒–染毒后继续禁食2~4h，但在禁食时要保障饮水。•6.实验动物的预检：–选择健康动物–1~2周的检疫期急性毒性作用二、急性毒性试验（二）试验动物的饲养环境–恒定的温度：22±3℃–湿度：30~70%–照度：昼夜各半–饲料合格、饮水合格、垫料合格急性毒性作用二、急性毒性试验（三）染毒途径的选择:染毒途径（exposureroutes）的选择需考虑：模拟人在生活和生产环境中实际接触受试物的途径和方式；有利于不同化学物之间急性毒性大小的比较；受试物的性质和用途；各种受试物毒性评价程序的要求等。最常用的染毒途径为经口、经呼吸道、经皮及注射途径。急性毒性作用•一般来说固态或液态的化学物均先进行经口染毒途径的急性毒性试验，求出LD50值来比较不同化学物急性毒性大小。•主要方法：灌胃法，喂饲法、吞咽胶囊法•灌胃法的优缺点：优点：可以准确控制染毒剂量；缺点：工作量大，操作需谨慎。•灌胃:小鼠0.21.0ml/只或0.10.5ml/10gbw大鼠一次灌胃体积不超过5ml/只家兔不超过10ml/2kgbw狗不超过50ml/10kgbw经口染毒喂饲法•将受试物拌入饲料或饮水中，让试验动物自由摄入。•优点：简单易行，符合人类接触的实际情况•缺点：有异味，动物拒食，使摄入量达不到设计剂量；易挥发物，易挥发损失，摄入量就不够准确。吞咽胶囊•将受试物装入胶囊内，强行放入动物舌后咽部，迫使其咽下。•优点：剂量准确，尤其是适用于易挥发，易水解及有异味的受试物。•缺点：动物有咬伤人的危险。经呼吸道染毒•研究生产条件下以气体、蒸汽、粉尘、烟、雾等形式存在的化学毒物和评价环境空气污染物以及吸入给药途径的药物。经皮肤染毒经注射途径染毒二、急性毒性试验•（四）染毒剂量与分组:1．查阅文献•①了解化学毒物的结构式、分子量、常温常压下的状态、熔点、沸点、密度、闪点、挥发度、蒸气压、水溶性和脂溶性等理化特性，生产批号及纯度，杂质成分与含量等。•②确定使用哪一种计算方法求LD50，然后再设计剂量分组。LD50的计算方法常用寇氏法、概率单位法、霍思法等。•③找出与受试化学毒物结构与理化性质近似的化学物的毒性资料，并以文献资料中相同的动物种系和相同接触途径所测得的LD50(LC50)值作为受试化学物的预期毒性中值。急性毒性作用二、急性毒性试验•（四）染毒剂量与分组:–2．预试验•①设定以此预期值作为待测化学物的中间剂量组，并在该剂量的上下各设计l一2个剂量组作为预试验剂量。•②根据确定的剂量组进行染毒。•③根据预试验的死亡资料确定组距。可根据以下公式计算出剂量分组：i=(lgLD90-lgLD10)／(n-1)或：i=(lgLD100-lgLD0)／(n-1)式中i为组距(相邻的两个剂量组对数剂量之差)；n为设计的剂量组数。急性毒性作用二、急性毒性试验•（四）染毒剂量与分组:–3．正式试验;•一般来说、根据试验设计所选用的LD50计算方法来确定组数。例如几率单位法、寇氏法一般设6～10个剂量组；霍恩法固定设4个剂量组。求得i值后．以最低剂量组(LD0或LD10)的对数剂量加上一个i值，即是第二个剂量组的对数剂量，依此类推直至最高剂量组，查各自的反对数即得出各组剂量的真实值。123456•LgLD0LgLD0+iLgLD0+2iLgLD0+3iLgLD0+4i•••急性毒性作用染毒剂量与分组（归纳总结）二、急性毒性试验•（五）试验周期与毒效应观察–1.中毒症状急性毒性作用二、急性毒性试验•（五）试验周期与毒效应观察:2.体重•在观察试验动物中毒症状的过程中，应同时观察体重的变化。体重可以反映动物中毒后的整体变化。体重改变的原因很多，若化学毒物刺激或损伤消化道可出现试验动物饮食减少甚至拒食，表现为体重减轻。若化学毒物引起腹泻，将影响食物吸收和利用，体重也会减轻。如果化学毒物影响水的摄取或肾功能急性损伤，也可能在体重上反映出来。所以，对存活动物尤其是对低于LD50剂量组的存活动物．应在观察期14天内称量其体重的变化．以便了解受试物引起毒效应的持续时间。急性毒性作用二、急性毒性试验•（五）试验周期与毒效应观察:–3.病理检查及其他指标:•对死亡的动物：均应及时进行大体解剖和病理组织学检查，肉眼观察主要脏器的大体病理变化，如脏器大小、外观、色泽的变化，有无充血、出血、水肿或其它改变，对有改变的脏器进行取材做组织病理学检查。•对存活动物：在观察期结束时进行大体病理检查．必要时做组织病理学检查。根据试验需要可进一步扩大观察项目．如体温、心电图、脑电图或进行某些生化指标测定等。急性毒性作用二、急性毒性试验•（五）试验周期与毒效应观察–4.死亡和死亡时间•重点观察和记录每只动物死亡的时间，特别是最早出现死亡的时间以及各个剂量组动物的死亡数。分析中毒死亡时间的规律具有一定意义，可为深人研究化学物的毒作用机制提供参考。急性毒性作用二、急性毒性试验•(六)经典急性毒性试验的局限性–1.消耗的动物量大–2.获得的信息有限–3.测得的LD50仅仅是一个近似值–4.在安全性评价中仅评价动物死亡和简单的症状观察是不够的，更需要的是生理学、血液学及其它化验检查所提供的深入细致的毒性信息。急性毒性作用(七)经典急性毒性试验评价WHO和欧盟对食品毒物急性毒性的分级WHO5级（大鼠）欧盟4级毒性分级经口LD50（mg/kg）毒性分级经口LD50（mg/kg）剧毒1高毒1～50高毒25中等毒50～500有毒25～200低毒500～50000有害200～2000微毒50000不分2000我国食品毒物急性毒性分级级别大鼠经口LD50（mg/kg）相当于体重70kg人的致死量第6级极毒1稍尝，7滴第5级剧毒1～507滴～1茶匙第4级中等毒51～5001茶匙～35g第3级低毒501～500035～350g第2级实际无毒5001～15000350～1050g第1级无毒150001050g急性毒性替代试验•一、基本概念•二、蓄积毒性试验方法及其评价蓄积作用及其评价§2蓄积毒性化学毒物进入机体后，经过生物转化以代谢产物或化学物原型排出体外。但是，当化学毒物反复多次给动物染毒，化学毒物进入机体的速度(或总量)超过代谢转化的速度和排泄的速度(或总量)时，化学毒物或其代谢产物就有可能