7-微生物的遗传变异与菌种选育

第七章微生物遗传与变异与育种通过本章的学习，要求掌握：1、遗传变异的物质基础2、基因突变的发生3、基因重组的原理和方法。4、基因工程的基本原理5、菌种保藏重点：细菌的基因重组难点：低频转导，高频转导，准性生殖微生物是理想的遗传学研究材料：①物种及代谢类型的多样性；②个体简单，营养体多为单倍体，基因组小；③繁殖快，易于累积不同的最终代谢产物及中间代谢物；④菌落形态特征的可见性与多样性；⑤环境条件对微生物群体中各个体作用的直接和均匀；⑥易变异、易得到营养缺陷型突变株；⑦一般都有相应的噬菌体；⑧存在着处于进化进程中的多种原始方式的有性生殖类型等。基因组genome：一种生物的全套基因。表现型phenotype：生物可见的或可测定的性状遗传型genotype：决定生物表现型的遗传因子同样遗传型的生物在不同外界条件下，会显现不同表现型，但遗传型并没有改变，这种变异为非遗传性变异，只能称适应或饰变(modification)；只有遗传型改变，从而引起表型变化才称为变异，它发生在基因水平上，可以遗传给子代。Serretiamarcescens在25℃下培养时，会产生一种深红色的灵杆菌素，把菌落染成鲜红色。可是，当培养在37℃下时，群体中所有细胞都不产色素。如果重新降温至25℃，产色素能力又得到恢复。这就是一种饰变。第一节遗传变异的物质基础一、证明DNA是遗传物质的经典实验①1928年，F.Griffith；1944年O.T.Avery肺炎链球菌（Streptococcuspneumoniae）转化试验。②1952年，A.D.Hershy、M.Chase的噬菌体感染实验。③1956年，H.Fraenkel-Conrat的TMV拆开和重建实验。Griffith的转化实验SR转化因子本质的阐明Hershey-Chase的噬菌体实验用35S和32P去分别标记大肠杆菌，然后再用T2噬菌体感染，即可分别得到标有35S和T2和32P的T2噬菌体。把标记噬菌体与其宿主大肠杆菌混合，经短时间(如10min)保温后，使T2完成吸附和侵入过程。在组织捣碎器中剧烈搅拌，使吸附在菌体外表的T2蛋白外壳脱离细胞并均匀分布。进行离心沉淀，再分别测定沉淀物和上清液中的同位素标记。实验结果发现，几乎全部的32P都和细菌一起出现在沉淀物中，而几乎全部35S都在上清液中。这意味着噬菌体的蛋白外壳经自然分离后仍留在细胞外部，只有核酸芯子才进入宿主体内；同时，由于最终能释放出一群具有与亲代同样蛋白外壳的完整的子代噬菌体，说明只有核酸才是其全部遗体信息的载体。后来通过电子显微镜的观察也证实了这个论点。TMV重建实验(TMV)(HRV)霍氏车前花叶病毒DNA的双螺旋结构图二、遗传物质在细胞中的存在1、真核生物染色体:DNA分子与组蛋白结合构成染色体，每条染色体有单一线性双链DNA分子。一个真核生物细胞内有多条染色体（脉孢菌7条，人23条）。真核细胞核物质外有核膜包围，形成完整细胞核。线粒体:真菌线粒体基因组的大小介于动物和植物线粒体基因组之间。叶绿体：光合生物叶绿体中存在DNA。真菌的质粒：酵母菌的质粒存在细胞核中。丝状真菌的质粒存在线粒体中。2、原核生物染色体:染色体仅由一条DNA组成，DNA为共价闭合环状双链,DNA不与组蛋白结合，一个细胞内只有一条染色体（单倍体haploid）。无核膜膜包围，只在细胞中央形成核区。质粒(plasmid):原核生物中，除染色体以外，还有能够自主复制的共价闭合环状DNA分子。它们携带少量遗传基因，决定细胞的某些性状，并非细菌生活必需。致育质粒能自我复制(主要依赖宿主细胞的抗性质粒复制酶体系)细菌素质粒具不亲和群性(不同质粒可在同一)降解质粒细胞内共存)毒性质粒稳定的遗传共生质粒代谢型质粒具有转移性隐蔽质粒(表型和功能未知的质粒)质粒的种类质粒的特性三、遗传信息的传递和基因表达1、微生物的遗传信息储存在基因中基因geneDNA分子的一定区段，携带特定的遗传信息，是具有自主复制能力的遗传功能单位。遗传信息通过DNA连上的核苷酸排列顺序表现出来。遗传学上每一基因都用3个小写斜体英文字母表示，如lac表示乳糖基因。基因的表型也用与基因相同的3个字母表示，但不用斜体，且第一个字母要大写，表示具有乳糖代谢特征的符号为Lac+，没有乳糖代谢特征的符号为Lac-。基因的种类:结构基因:决定多肽形成的碱基顺序称结构基因。一个结构基因表达后，产生一个多肽；即“一个基因一个酶”。调节基因：对结构基因起调节控制作用的基因称调节基因。跳跃基因：可在DNA上转移位置的基因称跳跃基因。例如:插入序列（IS因子）转座子（Tn因子）（1）、等位基因的存在与表达：a.对抗性的：只有一个基因能够表达,显性基因表达真核生物b.非对抗性的：两个显性，两个隐性。在原核细胞中:在完全单倍体原核细胞中，等位基因的概念是指决定某一性状的基因在野生型菌株和突变型菌株中是否都存在。基因表达2、基因的表达：基因表达机制:遵守中心法则以DNA为模板，通过RNA聚合酶转录出mRNA，然后将mRNA包含的碱基顺序在核糖体中翻译成相应氨基酸序列的多肽。①转录（transcription）双链DNA→单链，以其中一条为模板→互补mRNA②翻译(translation)mRNA→多肽(2)、操纵子和操纵基因的表达：一个操纵子是一段DNA碱基顺序，包括一个操纵基因和一个或几个结构基因。操纵子的模型是雅各布和莫诺1961年提出的，根据这一模型基因有结构基因，调节基因，操纵基因和启动基因之分，基因的活动受调节系统控制，而这种控制又与环境因子有关，如乳糖操纵子，麦芽糖操纵子。乳糖操纵子没有乳糖时，调节基因产物与操纵基因结合，阻止结构基因表达有乳糖时，乳糖与调节基因产物结合，操纵基因启动结构基因表达DNA链麦芽糖操纵子没有麦芽糖时，调节基因产物激活蛋白不与启动子结合，结构基因不表达有麦芽糖时，麦芽糖与调节基因产物激活蛋白结合，促进RNA聚合酶与启动子结合，结构基因表达DNA链第二节基因突变和诱变育种1.突变：指DNA上的核苷酸顺序发生了稳定的，可遗传的变化。基因突变：DNA链上一对或少数几对碱基发生改变而引起。染色体畸变：DNA链的大片段损失。自发突变：在自然条件下发生的基因突变，细菌的自发突变频率为10-5-10-7。诱发突变：利用物理化学因子处理微生物使其产生的突变。回复突变：突变菌株发生突变，回复到出发菌株的状态。突变包括突变分为突变机制：转换：DNA上一个嘌呤被另一个嘌呤或者一个嘧啶被另一个嘧啶所替代颠换：DNA上一个嘌呤被一个嘧啶替代或者一个嘧啶被另一个嘌呤替代添加DNA分子中多了一个或几个碱基，导致编码aa三联密码发生了改变，从而引起突变。缺失DNA分子中少了一个或几个碱基引起突变。如：GGGAAAUUUAAACCC甘赖苯丙赖脯加一个碱基后就变成了：AGGGAAAUUUAAACCC精谷异亮终止添加：abcXdefg缺失：abcDefg畸变（染色体大损伤）重复：abcabcde（由X射线等的辐射烷移位：abcparde化剂，亚硝酸等引起）倒位：abcfedg碱基置换移码突变点突变诱发突变基因突变类型：1、营养缺陷型2、抗性突变型3、条件致死突变型4、形态突变型5、抗原突变型6、产量突变型基因突变的特点：不对应性自发性稀有性独立性诱变性稳定性可逆性正向突变(forwardmutation)回复突变(backmatation或reversemutation）基因突变自发性和不对应性的证明1、变量试验：（FluctuationTest）：又称波动试验或彷徨试验。1943年美国学者鲁里亚（S、Luria）和德尔波留克（M、Delbrack）设计了此试验。2.涂布实验：（NewcombeExpetiment）1949年Newcombe设计了这一实验：先在12只培养皿中涂以数目相等的大肠杆菌细胞，经大约5小时培养，于是在平板上长出大量的微菌落，取其中6支直接喷上噬菌体，另6支先用灭菌玻璃棒均匀涂布一遍，然后再喷噬菌体，经过夜培养计算两组培养皿中抗性菌落数。（涂布可将抗性株涂开）。3.平板影印培养试验（ReplicaPlating）1952年莱德伯格夫妇（V，Lederberg）设计的实验：印章的做法是取一块比培养皿略小的木块，一端用绒布包起来，绒布上许多小纤维起到接种针的作用。在进行试验时，先用培养液培养大肠杆菌，再将菌液涂布在固体培养基上，待长出菌落后，用影印法先在新鲜的固体培养基上打一个印，再在含链霉素的另一个培养皿上打一个印。在含链霉素的培养皿上长出来的是抗链霉素突变体菌落然后再在不含链霉素的培养基上找出相应位置上的菌落，用含链霉素的培养基上找出相应位置上的菌落，用含链霉素的培养基鉴别，发现也是抗链霉素突变体，由于两者来源相同，说明是非链霉素诱变，而是自发的。微生物育种：1、自发突变育种生产育种定向培育：在某一特定条件下，长期培养某一微生物菌群，通过不断转接传代以积累自发突变，并最终获得优良菌株的过程。如预防结核病的制剂－－卡介苗，经历了13年，牛型结核分支杆菌转接230代。2、诱变育种用物理（X-ray、UV等）化学（吖啶、亚硝酸、碱基类似物）因素诱变育种，获得突变机率提高。艾姆氏试验（Amestest）利用细菌营养缺陷型的回复突变来检测环境或食品中的潜在三致物质。诱变育种的基本原则挑选优良的出发菌株自发突变株、具有有利形状、对诱变剂敏感敏感时期和合适对象的选择选择简便有效地诱变剂选用最适剂量高效的初筛和复筛透明圈法、抑菌圈法、变色圈法、生长圈法等突变体的筛选：A、营养突变体的筛选:完全培养基：基本培养基中加入了天然物质（蛋白胨，酵母膏等），能满足各种营养缺陷型M.生长的培养基。基本培养基：只含有野生型菌生长繁殖所必须养料的合成培养基叫基本培养基。a、青霉素浓缩法：用基本培养基培养细菌，并在其中加入青霉素，由于青霉素只能抑制生长着的细菌，故只杀死在基本培养基中生长的野生型细菌，而营养缺陷型突变体因不能在基本培养基中生长，青霉素对它们不起作用而被保留下来。b、菌丝过滤法：把霉菌和放线菌的孢子放在基本培养基里生长，这时只有野生型菌会萌发长出菌丝，而缺陷型孢子不会长成菌丝，通过过滤可除去野生型菌丝，而保留突变体孢子。营养缺陷型的检出点种法夹层培养法限量补充培养法(含00.1％以下蛋白胨的基本培养基)影印接种法B、抗性突变体的筛选:采用梯度培养法:C、产量突变体的筛选:采用琼脂块培养法:用梯度平板法筛选抗性突变体用琼脂块法筛选产量突变体DNA的损伤及其修复：A、光复活修复：在光复活酶的作用下，将嘧啶二聚体内的环丁酰环打开，使DNA恢复正常。B、错配修复：在DNA复制后清除错误配对的碱基。C、无碱基修复：无碱基修复能够恢复无碱基位置上的核苷酸，参与修复的酶是AP核酸内切酶，该酶作用于DNA链上无碱基位置的糖基，留下的单链缺口被DNA聚合酶和连接酶修复。D、核苷酸和碱基切除修复：首先由具有DNA识别活性的DNA内切核酸酶识别突变的碱基，然后在突变碱基两侧固定数目的碱基处，将包含有突变碱基的核苷酸片段切除，再在DNA聚合酶的作用下，修补合成一段新的DNA。E、复制后修复：在含有嘧啶二聚体或其他损伤的位置上，DNA仍然可以进行复制，但是在复制得到的子代中，其DNA链在损伤的对应部位上会留下缺口。在细胞内重组蛋白的作用下，可进行DNA分子间的重组，从原来完整的母链上，将相应的碱基序列转移到子链的空缺处。而母链中失去的部分再在DNA聚合酶的作用下，以其对应子链为模板，合成单链DNA来填补。最后在连接酶的作用下，以磷酸二酯键连接新旧链，完成重组修复过程，即复制后修复。F、SOS修复:SOS修复由SOS调控完成，涉及复杂的基因表达网络。化学诱变亚硝酸引起DNA的碱基转换5-BU尿嘧啶引起碱基的转换第三节基因重组和杂交育种克隆clone不经过有性细胞的结合，由体细胞发育成新个体，即无性繁殖。基因重组generecombination两个不