搜索
检验学院第二章微生物菌种选育检验学院检验学院二、工业微生物来源source1source2source3向菌种保藏机构索取从大自然中分离筛选从发酵制品中分离检验学院检验学院国际承认的中国培养物保藏单位武汉大学的中国典型培养物保藏中心CCTCC。保藏了几乎所有的培养物。(CCTCC)检验学院国际承认的中国培养物保藏单位中科院微生物研究所的中国普通微生物菌种保藏管理中心CGMCC。保藏有普通菌种。(CGMCC)检验学院此外，较著名的中国培养物保藏单位还有中国微生物菌种保藏管理委员会CCCCM——管理机构检验学院工作方案设计（分离）产品特性微生物生理学知识微生物生态学知识微生物生理学知识三、微生物菌种的选择性分离检验学院工作方案设计（筛选）产品性质、技术经济指标要求产品生产工艺解决质与量的矛盾三、微生物菌种的选择性分离检验学院三、微生物菌种的选择性分离微生物样品的采集微生物样品的富集培养目的菌种的分离目的菌的筛选1234检验学院1.采样（1）采样原则样品来源广泛根据代谢规律（所有菌初生代谢基本相同，次生代谢不同，丝状菌、芽孢菌）在已适应相当苛刻环境压力的微生物类群中寻找新菌种充分了解目标微生物的性质（种类、生理特征等）如根据微生物的营养类型：纤维素酶产生菌——森林土壤蛋白酶和脂肪酶产生菌——肉类加工厂和饭店潲水沟中的污水、污泥利用碳氢化合物为碳源的菌株——油田附近极端菌的筛选要根据其特殊的生理特征：高温酶产生菌——南方、温泉、火山爆发处及北方的肥堆耐压菌——油井或海洋深处检验学院(2)采样对象土壤、水、空气及枯枝落叶等，以土壤为主。从土壤中采样要考虑土壤的以下特点：①有机质含量和通风状况耕地、菜园山坡上的森林沙土、无植被土壤、新开垦的生土、贫瘠的土地②采样方法：去除表层土，取样的土层深度：5-25cm,几十克，装入无菌牛皮纸袋或塑料袋中（有机质丰富、通气保水性能好）——细菌、放线菌（有机质丰富、阴暗潮湿）——霉菌、酵母菌——微生物少1.采样检验学院1.采样③土壤的酸碱度偏碱——细菌、放线菌偏酸——霉菌、酵母菌④土壤的植被状况葡萄成熟时——根部酵母菌增多⑤地理条件南方土壤比北方土壤微生物含量多⑤季节条件秋季菜土样最理想注意事项记录：时间，地点，环境情况等；样品袋应封好口，防止水分失去；土样应在分离前破碎；尽快分离检验学院2.微生物样品的富集培养概念：利用不同微生物生长繁殖对环境和营养的不同要求，如温度、PH、渗透压、溶氧浓度、碳源和氮源类型及浓度等，人为控制这些条件，使之利于某种微生物的生长，已达到使目的菌种占优势而快速分离纯化的目的的一种方法。适用：样品中目的菌数量不够多时目的：提高样品中目的菌的数量和/或比例原理：通过控制营养成分或培养条件，使目的菌得以繁殖和/或非目的菌的生长受到抑制检验学院富集培养方法1控制培养基的营养成分2控制培养条件3抑制不需要的菌类检验学院方法控制营养成分纤维素为唯一碳源，可增殖分解纤维素的菌可溶性淀粉为唯一碳源，可增殖产淀粉酶的菌酒精废水，可以增殖废水处理菌多种微生物所利用的碳源、氮源不能作控制因素控制培养基pH细菌、放线菌：中性偏碱，真菌：偏酸但非目的菌的生长不能被完全抑制检验学院控制培养温度30℃左右培养，可培殖嗜温微生物50~60℃培养，可培殖嗜热微生物，筛选耐热菌株热处理——增殖芽孢细菌样品悬浮液经80℃、10分钟处理，杀死营养体，再添加营养培养后可增殖产芽孢细菌检验学院添加抑制剂10%酚数滴：抑制细菌霉菌生长，增殖放线菌抗生素：抑制细菌放线菌，增殖酵母、霉菌多粘菌素B：抑制G-细菌青霉素：抑制G+细菌制毒菌素：抑制真菌放线菌酮：抑制真菌检验学院3.目的菌种的分离方法平板稀释法平板划线法目的：将目的菌从混杂的微生物中分离出来，获得纯培养检验学院平板划线法b.连续划线分离法分区划线分离法检验学院1.稀释平皿分离法平板稀释法100ml1g9ml9ml9ml9ml9ml9ml1/1001/100010-810-710-610-510-41ml1ml1ml1ml1ml(1)稀释检验学院b.倾注平皿分离法a.涂布平皿分离法（2）倒平板检验学院用刚果红染色法鉴定筛选降解纤维素的菌株羧甲基纤维素钠作培养物抗生素筛选检定菌培养，加上发酵液4.目的菌的筛选这一步是采用与生产相近的培养基和培养条件，通过三角瓶的容量进行小型发酵试验，以求得适合于工业生产用菌种。检验学院影印平板法筛选目的菌检验学院四、重要工业微生物菌种的分离筛选菌株的一些重要指标：（1）菌的营养特征（2）菌的生长温度（3）菌对所采用的设备和生产过程的适应性（4）菌的稳定性（5）菌的产物得率和产物在培养液中的浓度（6）容易从培养液中回收产物。生产性能检验学院抗生素产生菌的筛选Text抗生素产生菌的筛选抑菌圈法稀释法生物自显影法扩散法检验学院产生药理活性化合物菌株的筛选药理活性化合物是指能抑制人类代谢中某一个关键酶的微生物产物即酶抑制剂，从而达到治疗的目的。多糖产生菌的筛选从菌落外观判断，选择外观呈粘液状的菌落，然后根据液体培养测定多糖含量来筛选高产菌。生长因子产生菌的筛选通过观察分离菌能否促进营养缺陷型菌株的生长，来检出生长因子产生菌。检验学院第二节发酵高产菌种选育菌种选育的目的1、提高发酵产量2、改进菌种的性能3、产生新的发酵产物4、去除多余的组分检验学院自然选育诱变育种杂交育种原生质体融合第二节发酵高产菌种的选育主要通过突变和筛选来获得优良菌株主要通过DNA重组来获得优良菌株基因工程育种检验学院一、自然选育自然选育概念：在生产过程中，不经过人工处理，利用菌种的自发突变，选育出优良菌种的过程。检验学院二、诱变育种诱变育种是利用物理或化学诱变剂处理均匀分散的微生物细胞群，促进其突变率大幅度提高，然后采用简便、快速和高效的筛选方法，从中挑选少数符合育种目的的突变株，以供生产实践或科学研究用。诱变育种包括诱变和筛选两部分。检验学院诱变育种的原理诱变育种的理论基础是基因突变，包括染色体突变和基因突变两类生物诱变剂化学诱变剂物理诱变剂紫外线快中子NTGNM烷化剂噬菌体转座子检验学院诱变育种步骤出发菌株的选择制备菌悬液诱变处理突变菌株的筛选检验学院选择纯种菌株（排除异核体）优良性状的菌株（产生孢子、生长速度）对诱变剂敏感的菌株同时选择几株不同的优良菌株（一）出发菌株的选择※检验学院(二)处理菌悬液的制备这一步骤的关键是制备单细胞和单孢子状态的、活力类似的菌悬液，为此要进行合适培养基的培养，并要离心，洗涤，过滤。带玻璃珠的三角瓶内,加无菌水检验学院(三)诱变处理1）选择原则不稳定菌株→温和的、常用的诱变剂；稳定菌株→强烈的、不常用的、诱变谱广的诱变剂不经常使用一种诱变剂，也不宜频繁更换。注意考虑诱变剂本身的特点。UV→DNA的嘧啶碱基；亚硝酸→嘌呤碱基诱变剂的选择检验学院高剂量：致死率90%-99.9%变异幅度大，但负变株多低剂量：致死率75%-80%负变株少，且突变菌株稳定2）诱变剂量的选择检验学院(四)突变菌株的筛选筛选分初筛和复筛。初筛以迅速筛出大量的达到初步要求的分离菌落为目的，以量为主。复筛则是精选，以质为主，也就是以精确度为主。因此在具体方法上就有差异。初筛和复筛均要有亲株作对照比较生产能力是否优良。复筛后的优良菌株要考查其稳定性、菌种特性和最适培养条件检验学院根据操作方法可分为随机筛选和理性化筛选随机筛选理性化筛选从产物形成的生理生化途径着手，进行有的放矢的筛选。如营养缺陷型、抗性突变株等。经过诱变处理后，进行平板分离，随机挑选单菌落，筛选高产菌株检验学院1）营养缺陷型菌株筛选理性化筛选所谓营养缺陷型菌株是微生物经诱变剂处理后产生的一种生化突变体。由于基因突变，它失去了合成某种物质（氨基酸、维生素或核苷酸碱基）的能力，在基本培养基上不能生长，大多数营养缺陷型菌株需要补加一定种类的有机物质后才能生长。检验学院与筛选营养缺陷型有关的三类培养基：①基本培养基（MM，minimalmedium）——能满足某一菌种的野生型菌株营养要求的最低成分的合成培养基。②补充培养基（SM，supplementalmedium）——在基本培养基中有针对性地补加某一种或几种营养成分，以满足相应的营养缺陷型菌株生长需要（其他营养缺陷型仍不能生长）的培养基。③完全培养基（CM，completemedium）——可满足该菌各种营养缺陷型菌株营养需要的天然或半合成培养基。检验学院原理：抗反馈阻遏和抗反馈抑制突变株都是由于代谢失调所造成的，在细胞中已经有大量最终代谢产物时仍然继续不断地合成这一产物。方法：选育结构类似物抗性突变株结构类似物是指一些和微生物体内代谢产物结构相类似的物质，因而能够引起反馈，但是它们不能参与生物合成。目的：突变株能够不受反馈抑制或是反馈阻遏影响，不断积累末端产物2）抗反馈阻遏和抗反馈抑制突变株的筛选检验学院几个概念反馈调节：当合成代谢途径的终产物或分支代谢途径的终产物过量积累时，抑制合成代谢途径的关键酶（往往是代谢途径或分支代谢途径第一步的酶）的活力或相关酶的合成。反馈调节分为反馈抑制和反馈阻遏。反馈抑制是指合成代谢途径终产物过量积累时对该途径前端某些关键酶酶活性的抑制作用。反馈阻遏是指微生物合成代谢中高浓度终产物对该途径上酶合成的抑制作用。检验学院3）组成型突变株的筛选及应用组成型突变株：在没有诱导底物存在时也能产生大量诱导酶的突变株。筛选原理：通过诱变处理，使调节基因发生突变，不产生有活性的阻遏蛋白，或者操纵基因发生突变不再能与阻遏物相结合，从而使诱导型酶变为组成型酶。检验学院筛选方法：创造一种有利于组成型菌株生长而不利于诱导型菌株生长的培养条件，造成对组成型突变株的选择优势；选择适当的鉴别培养基，直接在平板上识别两类菌落，从而把组成型突变株选择出来。检验学院4）抗性突变菌株的筛选抗生素抗性突变株•在抗生素产生菌选育中，通过筛选抗生素抗性突变可提高抗生素产量。•抗生素抗性突变株除能提高抗生素的产量外，还能提高其它代谢产物的量。条件抗性突变•因环境不同，能表现为野生型菌株的特性和突变型菌株特性的突变称为条件抗性突变或称为条件致死突变。•温度敏感突变常用于提高代谢产物产量致死营养缺陷检验学院定义人为利用真核微生物的有性生殖或准性生殖，或原核微生物的接合、F因子转导、转导和转化过程，促使两个具不同遗传性状的菌株发生基因重组，以获得性能优良的生产菌株。理论基础－基因重组一、定义和特点定向杂交后对诱变剂敏感—消除诱变效应饱和改变产品质量和产量操作复杂，技术要求高，推广和应用受限特点三、杂交育种检验学院杂交方式-DNA的转化检验学院杂交方式-转导（借助噬菌体）检验学院杂交方式-准性生殖准性生殖是指异核体（单个生物个体中含有两种或两种以上基因型）细胞中两个遗传物质不同的细胞核可以结合成杂合二倍体的细胞核。这种杂合二倍体的细胞核在有丝分裂过程中可以发生染色体单倍体化,最后形成遗传物质重组的单倍体的过程。也就是不经过减数分裂就能导致基因重组的生殖过程。检验学院四、原生质体融合定义通过人工方法，使遗传性状不同的两个细胞的原生质体发生融合，并产生重组子的过程，也叫细胞融合。提高细胞间重组频率打破物种界限将多个优良性状集中到一个菌株中对设备要求不高，一般实验室都可以进行原生质体融合的优点检验学院（一）原生质体融合育种步骤检验学院原生质体融合检验学院1.标记菌种的选择一般以营养缺陷型和抗药性等遗传形状作为标，且标记必须稳定。2.原生质体的制备在放线菌和细菌中，制备原生质体主要采用溶菌酶；酵母和霉菌一般可用蜗牛酶或纤维素酶等。1）菌体的前处理（EDTA、青霉素）2）菌体的培养时间4）酶处理温度3）酶浓度6）渗透压稳定剂（甘露醇、蔗糖、KCl）5）酶解时间检验学院3.原生质体融合在融合剂PEG和Ca2+作用下，发生原生质体融合。4.原生质体的再生再生培养基-由渗透压稳定剂和各种营养