DNA甲基化标志物在分子诊断与治疗中的价值

分子诊断与治疗杂志2009年9月第1卷第3期JMolDiagnTher,September2009,Vol.1No.3DNA甲基化标志物在分子诊断与治疗中的价值潘世扬[摘要]DNA甲基化是指基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶5号碳原子上共价结合一个甲基基团，其主要参与基因的表达调控。DNA甲基化异常与肿瘤等疾病密切相关。抑癌基因启动子区甲基化是肿瘤发生发展的重要事件。DNA甲基化，不仅可作为肿瘤分子诊断的标志物，同时也可作为分子治疗的靶标。[关键词]DNA甲基化；抑癌基因；分子；诊断；治疗DNAmethylationasabiomarkeranditsclinicalapplicationonmoleculardiagnosisandtreatmentPANShiyang(DepartmentofLaboratoryMedicine,theFirstAffiliatedHospitalofNanjingMedicalUniversity,Jiangsu,Nanjing210029,China)[ABSTRACT]DNAmethylationinvolvestheadditionofamethylgrouptothenumber5carbonofthecytosinepyrimidinering,participatingingeneexpressionregulation.AberrantDNAmethylationisassociatedwithhumandiseases,particularlyincancers.Methylationoftumorsuppressorgenepromoterisanimportanteventduringtheoccurrenceanddevelopmentoftumors.So，itcouldbenotonlyamoleculardiagnosticbiomarker，butalsoatherapeutictargetofcancerdiseases.[KEYWORDS]DNAmethylation;Tumorsuppressorgene;Molecule;Diagnosis;Therapy在最近的二十年中，随着新的DNA甲基化检测技术的建立和应用，DNA甲基化（DNAmethylation）在人类遗传表达及基因调控异常所致疾病中的作用，得到进一步地展示。许多基因的甲基化被证明与各种临床疾病密切相关，有些甚至可以被确定为疾病致病的独立因素。1DNA甲基化与表观遗传学的概念遗传物质染色体双链DNA中，胞嘧啶5号碳原子上增加的CH3基团被称为DNA甲基化[1]。DNA甲基化在人基因组中存在是一种十分常见的现象，通常胞嘧啶甲基化（C-CH3）发生在基因的启动子或编码序列的CpG中，这种基因的甲基化可能会对基因的结构和功能产生一定的影响，如使基因的表达发生异常，通常会使基因的表达降低或使基因沉默，最终导致生物体产生发育障碍或引起各种疾病[2~3]。一般认为基因的甲基化可以遗传，而这种遗传学的改变并非是由DNA的一级结构即四种碱基的突变和缺失等所致，而只是由甲基化和非甲基化胞嘧啶所致，由此DNA的序列并未发生变化，因此目前称这一改变为表观遗传学改变（epigeneticchange）。随着对基因调控研究的深入，已经诞生了与传统遗传学有本质差别的表观遗传学（epigenetics），也有称之为表遗传学。DNA甲基化，尤其是特定基因启动子部位的DNA甲基化被认为是基因表达的开关。干细胞中的某些基因启动子所存在的甲基化或非甲基化使得这些基因开放或关闭，最终可导致干细胞的定向分化。这一点可以从怀孕母体中检测到，在孕妇的血浆游离DNA中可同时检测到从母体来源的某一特定基因的甲基化以及从胎儿来源的启动子部位非甲基化[4]。证明在成年的基金项目：江苏省卫生厅重大项目科研基金（№:H200707）；江苏省科技厅社会发展基金（№:BS2007073，№:BM2006113）；江苏省实验诊断学重点实验室基金（№:XK200731）；江苏省医学检验学实验教学示范中心（№:JX222270071）作者单位：南京医科大学第一附属医院医学检验科，江苏，南京210029·述评···145分子诊断与治疗杂志2009年9月第1卷第3期JMolDiagnTher,September2009,Vol.1No.3女性中这一基因已经关闭，而在胎儿生长发育的时期这样的基因仍然在发挥着十分重要的作用。因此，基因的甲基化尤其是某些基因启动子部位的甲基化是基因开关的重要元件，研究这些基因的启动子部位在成人和胎儿之间的差异，不仅可以探索在个体正常发育过程中各个不同的基因所产生的程序性或交叉互动性的作用关系，同时也为个体发育异常、产前诊断以及后天由于表观遗传异常所致疾病的诊断提供重要的依据。2DNA甲基化检测技术的发展随着DNA甲基化在临床疾病中重要性认识的日益加深，促使临床实验诊断技术研究人员不断探索新的DNA甲基化检测技术。最初的DNA甲基化检测是利用非常繁琐的质谱技术，后来由HermanJG等[5]于1996年发明了甲基化特异性基因扩增检测技术。该技术的基本原理是通过化学物质对原始DNA的化学修饰，使得未发生DNA甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶，而甲基化DNA中的胞嘧啶由于有CH3基团的存在，经修饰后仍然保持甲基化胞嘧啶不变，从而使得原始的DNA模板在修饰后被区分开来，通过设计分别针对甲基化和非甲基化的两对基因扩增引物，分别对修饰后的模板进行甲基化特异性基因扩增（methylationspecificPCR，MSP），电泳后可判断原始模板DNA甲基化、非甲基化或两者均存在（即既有甲基化扩增产物，又有非甲基化扩增产物）。由于该技术的应用，使得在随后的十年中，每年数以百计的研究学术论文得以发表。目前，国内外许多医学研究机构已将这一检测技术用于对临床肿瘤等疾病的分子诊断和治疗研究中。尽管MSP检测技术为DNA甲基化的基础及临床研究带来了极大的方便，同时也拓展了DNA甲基化的研究空间，但是MSP仍然存在很大的局限性。其中主要有三点：首先要对DNA模板进行化学修饰，而这一过程不但耗时太长（通常为16h），而且由于化学修饰可对DNA产生降解，因此对于DNA含量少的检测样本，可能会由于化学修饰所致的DNA降解产生假阴性；其次是DNA扩增可能存在的产物污染；再者普通MSP是一种定性检测技术，做不到对待测模板中DNA甲基化的定量检测。因此，在随后的研究方法的探索中逐步有学者报道了采用实时荧光定量甲基化特异性基因扩增，即（quantitativereal-timemethylationspecificPCR，QMSP）[6~7]。由于考虑到多基因甲基化的同步检测，随后又有学者报道了定量甲基化基因芯片检测技术[8]，从而提高了检测的效率。而QMSP仍然是建立在对原始的DNA模板的化学修饰以及随后的基因扩增基础之上，因而仍然存在相应的缺陷。近年来，基于甲基化特异性核酸限制性内切酶的检测方法被广泛应用[9]。目前已经使用的酶有多种同时可以识别多个甲基化和非甲基化的特定核酸序列，可以做到对核酸样品进行快速的检测与分析。其基本的技术原理是以酶切替代了DNA的化学修饰，然后对产物进行扩增，以能否检测出该扩增产物来判定原始靶核酸中是否存在DNA甲基化的位点，方法十分简便。在最新发展的DNA甲基化检测技术中，多采用针对DNA甲基化的特异性结合蛋白或抗体，以及芯片检测技术平台，以达到快速高通量地检测DNA甲基化[10~11]。3抑癌基因（TSG）启动子甲基化的临床意义DNA异常甲基化，尤其是抑癌基因（tumorsuppressorgene，TSG）启动子高甲基化，已经被确认为是目前各种临床肿瘤早期基因改变事件[12]。在肿瘤细胞形成的初期就已经出现多种抑癌基因的低表达或不表达，由于在这样的细胞内出现了两种拮抗基因即抑癌基因和癌基因的表达失衡，从而加速了肿瘤的最终形成[13~14]。因此，TSG启动子甲基化是肿瘤的生物学标志。在绝大多数的临床肿瘤患者的肿瘤细胞中，可以检测到一个以上的TSG启动子甲基化，而在健康的细胞中没有。因此，可以通过检测特定TSG启动子甲基化对临床肿瘤进行分子诊断，也可以通过监测这一肿瘤标志物，跟踪观察临床化学治疗的疗效，这对肿瘤患者的预后评估具有重要的价值[15]。TSG启动子甲基化，不仅是肿瘤分子诊断的生物标志，同样也是肿瘤分子治疗的重要靶标。Sorm[16]等的研究，已证明通过使用去甲基化的药物可以使抑癌基因启动子去甲基化，从而恢复该抑癌基因的表达，如APC和RASSF-1A基因，可以用5-aza-dC使肺癌细胞系恢复这两种基因的表达。Kantarjian[17]等，对临床肿瘤患者也进行了相应的研究，结果证明去甲基化药物可以在人体产生作用使TSG恢复正常表达。然而，值得一提的是，目前所有去甲基化药物均无基因和组织器官的选择性；因此，将去甲基化药物用于人体时，这种药物可能不仅对所关注的肿瘤组织细胞中的某几种TSG启动子起到去甲基化的作用，同时对其他的··146分子诊断与治疗杂志2009年9月第1卷第3期JMolDiagnTher,September2009,Vol.1No.3一些癌基因DNA甲基化也会产生去甲基化的作用。所以，以抑癌基因甲基化作为靶标的去甲基化的临床治疗仍有很多未解开的谜团，必须慎重。4DNA甲基化研究的未来在DNA甲基化作为分子诊断和分子治疗的靶标正被逐步应用于临床的过程中，我们仍需知道：DNA甲基化为何能在形成的肿瘤细胞中被遗传；不同类型的肿瘤是否存在特定的抑癌基因甲基化方式；去甲基化的药物治疗是否会使人体某些特定细胞内的特定基因重新因去甲基化而开放，导致新的疾患。总之，DNA甲基化研究进展迅速，但已知的仅仅是冰山一角，仍有一个漫长的过程，需要更多学者的参与。参考文献[1]KapplerJW.ThekineticsofDNAmethylationinculturesofamouseadrenalcellline[J].JCellPhysiol,1970,75(1):21-31.[2]JonesPA,TakaiD.TheroleofDNAmethylationinmammalianepigenetics[J].Science,2001,293(5532):1068-1070.[3]张丽霞,潘世扬,陈丹,等.肺癌细胞株APC基因启动子甲基化对其转录的影响[J].癌症,2007,26(6):576-580.[4]ChimSS,JinS,LeeTY,etal.SystematicsearchforplacentalDNA-methylationmarkersonchromosome21:towardamaternalplasma-basedepigenetictestforfetaltrisomy21[J].Clinchem,2008,54(3):500-511.[5]HermanJG,GraffJR,MyohanenS,etal.Methylation-specificPCR:anovelPCRassayformethylationstatusofCpGislands[J].ProcNatlAcadSci,1996,93(18):9821-9826.[6]EadsCA,DanenbergKD,KawakamiK,etal.MethyLight:ahigh-throughputassaytomeasureDNAmethylation[J].NucleicAcidsRes,2000,28(8):E32.[7]高丽,潘世扬,束永前,等.实时荧光定量检测人血浆中RASSF1A基因启动子甲基化[J].临床检验杂志,2008,26(3):194-196.[8]潘世扬,王贤,张丽霞,等.APC基因甲基化定量检测芯片的建立[J].生物医学工程与临床,2008,12(2):154-158.[9]XiongZ,LairdPW.Cobra:asensiti