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第九章无病毒苗育苗•一、病毒危害•二、脱毒技术•三、无病毒苗育苗体系•四、柑桔工厂化无病毒容器育苗技术规程病毒危害•病毒病被称为植物的“癌症”。植物受病毒危害后在浸染组织的细胞内发生病理学变化，用解剖方法可以检查出来的称为病变，即内部症状；然后逐渐在外部表现出来的形态特征称为外部症状。•外部症状依据在叶片等组织上的分布情况，可分为局部症状和系统症状。局部症状是指将病毒接种植物叶片后，病毒沿浸染点周围产生斑点，分别形成褪绿斑、坏死斑、环斑；系统症状是指病毒浸染寄主后能够在整个植株中运输并产生危害，在叶片、茎杆、果实等组织系统产生症状。•各种果树，特别是柑桔、葡萄、苹果、梨、桃、枣树等，一旦感染上病毒后，代代相传，越积越严重，使果树长势逐年衰退，产量大幅度下降，品质严重变劣，品种退化，食用价值与商品价值大大降低。病害严重的还可能导致整个植株枯死或完全丧失结果能力。•果树是多年生植物，果树病毒多由嫁接传染，一旦病毒侵入树体后，在自然条件下就会永远存在树体中，无法消除。在长期的无性繁殖过程中，大多数果树都会积累和感染各种病毒。有的表现为潜隐病毒症状，病树外表性状不明显，但会导致树势衰弱、产量下降、品质变劣，影响生产效益。当砧穗组合改变而其中一方不耐病时，即可变成急性危害，即非潜隐病毒症状，树势急剧衰退，甚至枯死。•防治果树病毒类病害，目前尚无有效的化学或生物药剂，也难以运用选育抗病品种来达到防治目的，攻克这一植物“癌症”唯一有效的方法是实行无病毒繁育。这样就可以完全避免病毒类病害的危害，因为果树的病毒性病害主要通过嫁接与无性繁殖器官进行传染，全面推广无病毒果树种、苗，杜绝病毒类危害的传染来源，不仅可以减少经济损失，而且有利于改善果实品质和保护生态环境。•无病毒繁育是指在无病毒的种、苗繁殖基地，生产、繁殖无病毒类病害的种、苗，在新区全面种植，或在老区用无病毒的种、苗逐步进行更新换代。•常见的马铃薯病毒病有3种类型。花叶型叶面叶绿素分布不均，呈浓绿淡绿相间或黄绿相间斑驳花叶，严重时叶片皱缩，全株矮化，有时伴有叶脉透明；坏死型叶、叶脉、叶柄及枝条、茎部都可出现褐色坏死斑，病斑发展连接成坏死条斑，严重时全叶枯死或萎蔫脱落；卷叶型叶片沿主脉或自边缘向内翻转，变硬、革质化，严重时每张小叶呈筒状。此外还有复合侵染，引致马铃薯发生条斑坏死。•在马铃薯栽培过程中,植株的逐年变小,叶片皱缩卷曲,叶色浓淡不均,茎块变形龟裂,产量逐年下降等现象,就表明马铃薯已经发生“退化”,种薯“退化”是其产量降低和商品形状变差的主要原因。•科学家经过对马铃薯“退化”深入的研究,最终明确了病毒的侵染及其在薯块内积累是马铃薯“退化”的主要原因。•防治方法(1)采用无毒种薯，建立无毒种薯繁育基地，原种田应设在高纬度或高海拔地区，并通过各种检测方法汰除病薯，推广茎尖组织脱毒，获得种薯。(2)培育或利用抗病或耐病品种(3)出苗前后及时防治蚜虫(4)改进栽培措施。包括留种田远离茄科菜地；及早拔除病株；实行精耕细作，高垄栽培，及时培土；避免偏施过施氮肥，增施磷钾肥；注意中耕除草；控制秋水，严防大水漫灌。(5)发病初期喷洒抗毒丰(0.5％菇类蛋白多糖水剂)300倍液•目前应用最广泛而且在农业生产和商业生产中取得巨大成功的植物脱毒技术,是生物技术中的植物茎尖分生组织培养脱毒技术,也就是马铃薯脱毒种薯生产中常说的“茎尖脱毒”,•此项技术是根据植物细胞全能性学说、病毒在植株体内分布不均匀及茎尖分生组织带毒少的原理,结合使用钝化病毒的热处理方法,通过剥取茎尖分生组织进行培养获得脱毒植株,从而获得脱毒马铃薯。•选择优质健康的材料•田间选择要注意这样几方面的事项:所选的植株必须是表现典型的本品种特性的植株,符合准备脱毒品种的特征包括株型、叶形、花色等植物学性状及成熟期等农艺性状;植株生长健壮,无明显的病毒性、真菌性、细菌性病害症状;单株产量和大薯率高;适时早收,选择符合品种特性,无病斑、虫蛀和机械创伤的大薯块。•通常培养茎尖越小,产生幼苗的无毒率越高,而成活率越低。不同病毒种类取出的难易程度不同。因此需针对不同的病毒种类,培养适当大小的茎尖。•马铃薯病毒去除难易顺序是:马铃薯纺锤块茎病毒马铃薯S病毒马铃薯X病毒马铃薯M病毒奥古巴病毒马铃薯Y病毒马铃薯A病毒马铃薯卷叶病毒。对于同一种病毒,剥离茎尖越小,脱毒率越高。脱毒技术•植物脱毒技术是利用植物茎尖组织培养,结合血清学病毒检测技术,在防蚜传毒条件下,将影响作物正常生长的植物病毒全部脱除的高新农业技术。通常将一两个叶原基的茎尖接种在一定的培养基上,进行无菌培养,直到长成试管苗,在确定不带任何病毒的情况下,快速繁育脱毒苗,以供推广应用。植物脱毒技术,实际上就是“克隆技术”在农业生产中的应用。•为了避免病毒的危害，就必须清除病毒，使之无病毒化，这是病毒病防治的关键。解决的方法有三种：•一是选拔品种纯正、健壮、品质产量都好的单株，确认无病毒后即可获得母本；•二是引进无病毒品种；•三是人工培育无病毒母本1热处理脱毒•热处理脱毒的技术原理是利用病毒与寄主细胞对高温的忍耐程度不同，选择适当的温度和处理时间，使寄主体内病毒的浓度降低、运行速度减慢或失活，而寄主细胞仍然存活并加快分裂和生长，使植物的生长速度超过病毒的扩散速度，得到一小部分不含病毒的植物分生组织，进行无毒个体培育，使生长点附近不带病毒，从而达到脱毒的目的。•热处理是对整株或植株的一部分(如接穗)，在钝化病毒温度和植物体能忍受温度的范围内，保持相对温度，经热处理装置处理一定的时间，杀死病毒而保持处理材料的生理活性。①温汤浸渍处理。适用于切下的材料，将之在50℃左右的温水中浸渍数分钟至数小时，方法简便易行，但易致材料受伤。②热风处理。将生长的盆栽植物移入室内或生长箱内，处理温度和时间因植物种类和器官生理状况而异。一般为35-40℃，短则几十分钟，长可达数月。每一种植物都有它的高温处理临界温度，超出这个温度，或温度虽在此范围内但处理时间过长，组织都会受伤。可以采用变温方法，即每天40℃处理4小时，16～20℃处理20小时，这样，既可保持芽眼的活力，亦可清除芽眼中幼叶的病毒。③热空气处理。热处理法中最主要的影响因素是温度和时间。在热空气处理过程中，温度越高、时间越长，脱毒效果就越好，但同时植物的生存率却呈下降趋势。所以温度选择应当考虑脱毒效果和植物耐性两个方面。洪霓等在梨病毒的脱毒研究中采用两种处理方式，一为恒温处理，温度控制在37±1℃；二为变温处理，温度为32℃和38℃，每隔8小时变换一次，发现变温处理比恒温处理植株死亡率低，脱毒效率高。•高温脱毒法是利用病毒粒子不耐高温的特点，使用高温使病毒粒子钝化失活的原理来灭活病毒。廖俊杰等将草莓栽于盆钵中置于38℃的温箱中处理，发现处理15天无脱毒效果，处理90天脱毒率仅为66％。所以高温脱毒时间长，效果差，且植物长时间在高温下容易死亡。需要将植物根部进行降温处理(盆钵用水对进行冷却等)，操作起来很麻烦。•热处理脱毒法已应用多年，被世界多个国家所利用。该项技术要求的设备条件比较简单，脱毒操作也比较容易。主要缺点是脱毒时间长，脱毒不完全，例如杆状病毒就不能用这种方法脱除，因而该方法有一定的局限性。因此，单独用高温处理的很少见，大多是采用高温处理和茎尖培养相结合的方法2.低温处理低温处理亦称冷疗法。菊花植株在5℃条件下分别处理4个月或7.5个月，没有菊花矮化病毒(CSV)的无病毒苗分别是67％和73％，而没有菊花褪绿斑驳病毒(CCMV)的无病毒苗分别是22％和49％，未经处理的茎尖则无脱毒效果。3.茎尖培养脱毒•茎尖培养脱毒的原理：一是利用了植物细胞的全能性，即植物细胞在形态建成方面具有极大的可塑性，可以在特定条件下分化出不同的细胞、组织以及器官，最终再生成完整植株；二是根据病毒在植物体内运转及分布的特点和规律，采取茎尖分生组织离体培养的方法获取无病毒试管苗。•在茎尖培养脱毒的整个过程中，植物体内病毒靠维管束系统移动，分生组织中没有维管束存在，病毒只靠胞间连丝移动，速度很慢，难以追上生长活跃的分生组织，所以生长旺盛的根尖、茎尖一般都无病毒或很少有病毒分布。•影响茎尖成活及脱毒的因素很多，但关键因素有两个：一是茎尖的大小。一般说来，剥离茎尖愈大愈易成活，但病毒愈难脱除。要求在双筒解剖镜下，用锋利的解剖刀迅速、准确地操作，茎尖剥离大小一般0.2-0.5mm，并带有1-2个叶原基。二是选择适宜的培养基，以提高获得完整健壮脱毒植株的成功率。•茎尖培养脱毒法脱毒率高，脱毒速度快，能在较短的时间内得到较多的原种繁殖材料，但这种方法的缺点是植物的存活率低。为了克服这一缺点，现在经常是将热处理与茎尖培养结合起来使用。热处理与茎尖培养相结合之所以能够提高脱毒效果，是由于热处理可使植物生长本身所具有的顶端免疫区得以扩大，有利于切取较大的茎尖(在1mm左右)，从而能够提高培养或嫁接的成活率。4热处理与茎尖培养相结合脱毒•用热处理方法给植株脱毒，所用时间长，植株易死亡，且脱毒率不高；而用茎尖培养需在解剖镜下切取很短的茎尖，操作和培养都很困难，且脱毒率低。如果把热处理和茎尖培养结合起来，则茎尖可适当取长，培养也容易。•可切取0.5mm长的茎尖培养成试管苗后，再将试管苗进行热处理。组培苗在密封的环境中能适应高温，可省去根部保护的麻烦操作，植株成活率及脱毒率均较高。•于丽杰等切取茎尖0.2-0.3mm培养成苗后，将组培苗用38℃处理28-30天，脱毒率为72.7％-95.5％。•廖俊杰等用38℃高温处理组培苗46天，脱毒率为100％。•高庆玉等取3mm长的茎尖培养成苗后，分别用35℃和38℃两种温度处理3-4周，发现35℃下处理无脱毒效果，处理4周后再切取1mm茎尖培养，脱毒率为20％；而38℃下处理2周或3周，脱毒率分别为20％和60％。38℃下处理2周后再切取1mm的茎尖培养，成活率和无毒率均较高。•高山林将茎尖进行短时高温处理，然后切取0.2-0.3mm长的茎尖培养，脱毒率为100％。•可以看出，茎尖培养与高温处理相结合比单纯的高温处理或茎尖培养脱毒率高得多。2种方法：从热处理后的取嫩梢，剥取0.4-0.5mm大小的茎尖进行培养；或从田间取嫩梢，剥切稍长的茎尖培养成株，在光照培养箱中热处理后，再切取梢端培养成株。5花药培养脱毒•利用花药培养是获得无毒苗的一种新方法。日本的大泽胜次等人首次发现了草莓花药培养，培育出10余个品种的无病毒母株，脱除病毒株率平均在80％以上。•花药培养有时可不经分化培养基而直接出芽，但出芽率低。愈伤组织直径2～3mm时，应及时转入分化培养基。•自然加倍；人工加倍•花药培养脱毒的原理还不太清楚。有人认为，可能是愈伤组织形成或愈伤组织诱导的某一过程中脱掉了病毒；也有人认为，可能是病毒的复制速度赶不上愈伤组织的增殖速度而脱掉了病毒。高庆玉认为，幼叶和茎尖也可以通过愈伤组织途径再生植株，而脱毒率约为20％，因此认为愈伤组织途径并不都能脱掉病毒。6微体嫁接脱毒•木本植物茎尖培养难以生根形成植株。为了克服这个困难，可将实生苗砧木培育在培养基上，再从成年无病毒树枝上切取茎尖(0.14-1.0mm)，在砧木切断面上进行试管微体嫁接。它是以试管中的幼小植株作砧木，将茎尖分生组织嫁接其上的一种脱毒方法，它比茎尖培养的成苗率高，同时生长速度也较快，可获得无病毒的幼苗。•最早成功进行微嫁接的是Murashige等，他们用这种方法脱除了柑桔的两种病毒。Englebrecht等将葡萄茎尖(0.1-0.5mm)嫁接到去顶的葡萄苗维管束环上，或者扦插到无毒砧木顶端切成的凹陷中，嫁接3周后长出新苗，获得无毒植株。•利用这个方法，柑橘类嫁接成活率为30％-50％，移栽成活率约95％，嫁接两年后即可结实。可获得柑橘类没有银屑病植株，桃树没有洋李环斑病毒、洋李矮缩病毒、褪绿叶斑病毒的无病毒苗。•目前嫁接成功的植物还有杏、酿酒葡萄、桉树、山茶、桃、苹果等。•微体嫁接技术难度较大，不容易掌握，与实际应用还有相当距离。但是，随着对无病毒苗木需要量的不断增加，预计在不久的将来，微体嫁