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Westernblot实验技术概论印迹法是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNA－RNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern印迹法(southernblot)。而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析。Northernblot:对RNA的印迹分析Westernblot:对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析Easternblot:对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析概论Westernblot：把电泳分离的蛋白质转移到固定膜上，并用抗原抗体反应进行特异性检测的过程。是集电泳、转印和免疫标记为一体的蛋白质分离检测技术,结合了凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测定的特异敏感等特点，可检测到低至1～5ng（最低可到10－100pg）的靶蛋白。Westernblot是检测蛋白质混合溶液中目的蛋白的定性方法，也可作为确定目的蛋白在不同细胞或同种细胞在不同条件下的相对含量的半定量方法Westernblot测定的不是蛋白的绝对含量，只是目的蛋白的相对含量：目的蛋白的存在与否特定实验条件下目的蛋白表达量的变化多种因素影响信号的强弱受，一般仅作为半定量指标不同目的蛋白由于所用检测的抗体不同，其含量不具有可比性WesternBlot一般流程蛋白样品的制备SDS-PAGE电泳转膜鉴定膜上特定蛋白封闭一抗杂交二抗杂交底物显色WesternblottingIsolationIdentification1.蛋白样品提取：总体原则1）提取时尽可能只集中于提取目的蛋白。通过采用不同提取方法或选择不同的试剂盒产品2）保持蛋白的处于溶解状态通过裂解液的PH盐浓度表面活性剂、还原剂等的选择3）提取过程防止蛋白降解、聚集、沉淀、修饰等，低温操作，加入合适的蛋白酶和磷酸酶抑制剂4）尽量去除核酸，多糖，脂类等干扰分子通过加入核酸酶或采取不同提取策略5）样品分装，长期于-80℃中保存，避免反复冻融。一、蛋白质的样品制备通过稀释使不同样品具有相同浓度，必要时需要对蛋白进行浓缩。常用的蛋白浓度测定方法包括：Bradford法，Lowry法，BCA法2.蛋白质浓度测定方法原理灵敏性干扰因素应用Lowry法Folin－酚试剂法蛋白质在碱性溶液中肽键与Cu2+螯合，形成蛋白质一铜复合物，还原酚磷钼酸产生蓝色化合物，蓝色深浅与蛋白质浓度呈线性关系较高（约5μg/ml）适用于脂类含量较高的样品测定，也能耐受相当浓度的去垢剂如SDS。受硫酸铵；Tris缓冲液；甘氨酸；各种硫醇干扰•耗费时间长40～60分钟；•操作要严格计时；•颜色深浅随不同蛋白质变化;•标准曲线不是严格的直线形式，专一性较差Bradford法考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合呈蓝色，在波长595nm吸收峰，在一定的范围内与蛋白质的含量呈线性关系高（约1～5μg/ml）,易受强碱性缓冲液，TritonX-100，SDS等去污剂的影响•快速5～15分钟，颜色稳定；•深浅随不同蛋白质变化;•标准曲线有轻微的非线性BCA法BCA法基于双缩脲原理，碱性条件下蛋白质将Cu2+还原成Cu+，BCA螯合Cu1+作为显色剂，产生兰紫色并在562nm有吸收峰很高（0.5-20μg/ml）不易受一般浓度去污剂的干扰可受螯合剂、略高浓度的还原剂的影响•较快40分钟内，•抗干扰能力强SDS-PAGE电泳，是在PAGE系统中引进SDS（十二烷基硫酸钠），SDS能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的空间结构，而电泳系统中存在的强还原剂（DTT或β-巯基乙醇）能使半胱氨酸之间的二硫键断裂，蛋白质在一定浓度的的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合，形成带负电荷的棒状结构的SDS-蛋白质复合物，降低或消除了不同蛋白质分子间天然的电荷和分子形状的差异，蛋白质在电泳时的迁移速度仅取决于其分子大小。二.SDS-PAGE电泳当SDS单体浓度1mm时，大多数蛋白质与SDS的结合比为1.4gSDS/g蛋白质)，形成蛋白质SDS复合物当分子量在15～200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX式中：MW:分子量X:迁移率k、b:常数电泳迁移率与分子量的对数呈线性关SDS－PAGE电泳消除了原携带电荷的差别，迁移仅与分子量有关除了电荷作用，同时具有分子筛作用丙烯酰胺(Arc)和N,N’-亚甲双丙烯酰胺(Bis)SDS配胶的Tris缓冲液TEMEDAP(时间)Tris-甘氨酸电泳缓冲液凝胶成份以温热(利于溶解)的去离子水配制含有29%(w/v)Arc和1%(w/v)Bis储存液,储于棕色瓶，4℃避光保存。使用期不得超过两个月，隔几个月须重新配制。如有沉淀，可以过滤。催化过硫酸铵形成自由基而加速两种丙稀酰胺的聚合。PH太低时，聚合反应受到抑制。Mini系列是8.6x6.8cmBio-RedMini电泳装置SDS－PAGE电泳分离只取决于分子解聚后SDS-蛋白质胶束的大小，因此凝胶浓度的正确选择尤为重要。不同分子量范围的蛋白质应选用不同浓度的凝胶浓度。浓度太大，孔径太小，电泳时样品分子不能进入凝胶。浓度太小，孔径太大，则样品中各种蛋白分子均随着缓冲液流向前推进而不能得以很好地分离。凝胶浓度的选择PAGE胶的孔径随“Bis～Arc”比率的增加而变小，比率接近1：20时孔径达到最小值。SDS聚丙烯酰胺凝胶大多按“Bis～Arc”为1：29配制，研究表明它能分离分子量大小相差只有3%的蛋白质。凝胶浓度与蛋白分离范围对于具有不同迁移率的多组分样品，很难选择一种浓度的凝胶来分离，此时最好使用梯度胶。Gel5%10%15%294566972002945669720029456697200一般来说，在被分析的蛋白质稳定的pH范围，凡不与SDS发生相互作用的缓冲液都可以使用。最常见的凝胶电泳缓冲液由Tris-甘氨酸或Tris-tricine组成。分离很宽分子量范围（6-200KD）的蛋白质适于分离小分子蛋白质（10KD）电泳缓冲系统蛋白分子量标准(marker)未染色marker是最简单,最准确的marker。由于没有附带染料分子或者是标记分子，所示大小正好是蛋白原本的大小。现在的Marker多数都选用预混和的Marker，方便不同大小的蛋白比较。预混的Marker通常有几条带加倍浓度作为指示，以方便辨认宽分子量蛋白标准高分子量蛋白标准低分子量蛋白标准预染蛋白分子量标准预染蛋白分子量是纯化好的蛋白混合物，与染料共价耦联。优点：及时监测电泳情况和估计迁移率直接观察蛋白转膜效率可以在膜上标记蛋白分子量缺点：预染Marker与染料共价耦联，电泳时迁移特性可能会发生改变，不适合精确定位蛋白通常预染marker的条带和目标蛋白不完全一样，只是参考大小，在不需要区分大小相近的条带时，预染Marker很方便实用。预染蛋白标准可以分为两种：单色预染和多色预染注意：由于转膜是一个将胶里的Marker浓缩在洁白的膜上，所以需要的marker上样量相对较少，但要在电泳过程中看到预染Marker，常需要比说明书里多加一些Marker。优点：1.包装方便携带和使用常温储存在48孔板中，使用不需解冻，只需用枪头刺穿外层薄片，将枪头中的10ul去离子水注入Marker干粉中吸起来就可使用2.独立包装可以防止污染3.分子量范围较广，从18.5kD到215kD（4-20%SDS-PAGE）4.凝胶上和转移膜上各条带分布水平和显色水平一致5.可用于染色（考马斯亮蓝染色和银染）。BlueRangerPrestainedProteinMWMMix（Pierce产品）：110元／次单色预染的极品内参照（Loadingcontrols）电泳步骤1.试剂准备需要注意的事项：Arc和Bis的有效性AP的有效性2.玻璃板的准备制胶架注意渗漏3.配胶和灌胶积层胶和分离胶梳子及其选择凝胶浓度的选择：根据目的蛋白的分子量要考虑的因素：温度需要注意的事项：过硫酸胺最后加气泡分离胶不要灌得太满。gel通常在0.5-1h内凝集最好。混合搅拌速度要适当，太快产生气泡影响聚合，导致电泳带畸形；太慢不均匀。注意事项4.样品准备和点样样品按1:1加入2xSDS加样缓冲液，煮沸3-5min。注意水蒸气的小问题分子量标准内参阳性对照5.电泳积层胶：低电压分离胶：高电压注意电泳时间，当溴酚蓝指示到凝胶尽头时停止。注意正负极影响电泳效果的因素：1.电压低电压会使胶的分子筛效应得到充分发挥。电压越小，条带越漂亮。2.胶的均匀度胶越均匀，条带越窄，分离越均匀。︶条带呈笑脸状凝胶冷却不均匀，中间冷却不好︵条带呈皱眉状•可能凝胶和玻璃挡板底部有气泡，•两边聚合不完全拖尾样品溶解不好纹理（纵向条纹）样品中含有不溶性颗粒条带偏斜电极不平衡或者加样位置偏斜条带两边扩散加样量过多电泳中出现的现象及原因电泳结果检查：考马斯亮蓝染色：使用简便快速，可以分辨1ug左右的条带，是最经济通用的蛋白PAGE胶电泳染色方法。银染：操作复杂一些但分辨率高很多，可以分辨2-5ng蛋白。以上两种染色方法染料与蛋白不可逆结合，干扰后面的WesternBlot实验，可选择同样的样品跑2块胶，一块染色一块转膜半干法将凝胶和固相基质象三明治一样加在用缓冲液湿润滤纸之间，电转10－30min。湿法将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸泡在转移装置的缓冲液中，电转45min或过夜。三、蛋白质转移(转膜)转膜方法选择原则：a.膜与目的蛋白的结合能力（单位面积的膜结合蛋白的载量）以及膜的孔径（拦截蛋白的大小）；b.不影响后续的显色检测（适和用于所选的显色方法，信噪比好）；c.根据不同目的来挑选不同的转移膜，如要做蛋白测序或者质谱分析。转印膜常用的固定化膜：NC膜（硝酸纤维素膜）和PVDF膜。1.蛋白印迹最广泛使用的转移介质，对蛋白有较强的结合能力（80－100ug/cm2)。2.适用于各种显色方法，同位素，化学发光（Luminol类）、常规显色、荧光显色；3.背景低，信噪比高。4.转移到NC膜上的蛋白在合适的条件下可以稳定保存很长时间。Schleicher&Schull公司的实验表明，转移到NC膜上的蛋白4℃条件下保存5年依然保持免疫识别特性，可以得到清晰可信的WesternBlot结果。优点硝酸纤维素膜(nitrocellulosefiltermembrane，NC膜)纯的硝纤膜较脆，易卷，不适合用于需要多次重复清洗的用途缺点注意1.硝纤膜孔径选择：20KD蛋白：选择0.45um孔径的膜，20KD蛋白：选择0.2um的，7KD蛋白：选择0.1um的膜。2.选择纯的NC膜（混有含醋酸纤维（CM）的NC膜结合力会降低）。3.选择合适的去垢剂：NC膜上结合的蛋白会因为某些去污剂而被代替，因此在封闭时最好使用较温和的Tween20，而且浓度不要超过0.3%常见生产公司：Schleicher&SchullMilliporePALL罗氏InvitrogenGE（Amersham）SantaCruz均有NC产品Schleicher&Schull是第一个提供硝纤膜的厂家，其NC膜分为纯NC膜和强化NC膜两种：ProtranNC膜OptitranNC膜Protran特点：100%PureNC，蛋白结合能力强低背景、多孔径选择（0.45,0.2,0.1um）保存时间长（实验证明膜上蛋白辨认时间可长达5年）纯NC膜，比较脆，机械耐受力欠佳，需小心操作Schleicher&Schull”“王牌“产品——纯NC膜Optitran：在超薄聚酯支撑膜的两面均匀铺上100%纯的硝酸纤维素，外表和纯NC膜完全一样，保持了NC膜各种优点，内部多了中性支持物，其柔韧度和机械耐受力高于NC膜，不容易卷曲，特别适于重复标记和洗脱的实验。蛋白结合力不如纯NC膜结合能力强(75-90µg/cm2)。Schleicher&Schull的强化NC膜PVDF