实验报告-细胞骨架的荧光观察

细胞生物学实验报告实验三细胞骨架的荧光染色1引言1.1实验目的1.了解荧光探针的基本知识2．学习荧光显微镜的工作原理及使用方法3.掌握细胞核和微丝骨架的标记技术1.2实验原理细胞骨架：细胞骨架是真核细胞中由蛋白质聚合而成的三维的纤维状网架体系。细胞骨架包括微丝、微管和中间纤维。细胞骨架在维持细胞形态，承受外力、保持细胞内部结构的有序性方面起重要作用。鬼笔环肽是从一种毒性菇类中分离的剧毒生物碱，它同细胞松弛素的作用相反,只与聚合的微丝结合,而不与肌动蛋白单体分子结合。它同聚合的微丝结合后,抑制了微丝的解体,因而破坏了微丝的聚合和解聚的动态平衡。Hoechst33342是一种亲脂性物质，能与DNA特异性结合的荧光探针，所以被大量用于活细胞的观察和定量的研究。荧光激发和发射波长分别为350nm和461nm。2实验仪器、试剂及操作步骤2.1实验仪器荧光显微镜、载玻片、盖片、滴管、滤纸、35mm细胞培养皿（六孔板）、湿盒2.2实验试剂PEM缓冲液、0.5%TritonX-100、4%多聚甲醛、Hoechst.33342储存液:1mg/mL(溶于PBS)55nMAlex-phalloidin（鬼笔环肽）2.3实验材料鼠胚成纤维细胞、鸡胚成纤维细胞2.4实验步骤1.将原代培养的成纤维细胞放于于小盖玻片上，在含10%胎牛血清的DMEM培养基中于37℃,5%CO2培养箱中培养至细胞融合度达70%～80%。2.取出培养有细胞的小盖玻片，置于小平皿中用37℃预温PEM轻轻漂洗3次。3.加入37℃预温4%多聚甲醛固定15min。4.用37℃预温PEM漂洗3次。5.加入0.5%TritonX-100通透处理约10min。6.用37℃预温PEM漂洗3次。7.取一个洁净的载玻片，按照载玻片的大小在其上放置一条封口膜，在封口膜上上滴加10ul55nMAlexa-568-phalloidin(绿)，将经上述处理的盖玻片细胞面向下孵育于染色液中，于湿盒中室温避光染色30min。8.小心取下盖玻片，将其置于小平皿中（细胞生长的面朝上），用37℃预温PEM避光漂洗3次。9.在载玻片上分别滴加Ho.33342工作液10ul，将盖玻片上的细胞倒扣在载玻片上室温暗处孵育10min。10.封片。11.荧光显微镜观察微丝（蓝色荧光激发，产生绿色荧光）；核（紫外光激发，产生蓝色荧光）。3结果与分析3.1细胞骨架染色结果图1鸡胚成纤维细胞骨架染色时在荧光显微镜下的状态图注：细胞为鸡胚成纤维细胞，进行爬片培养后骨架染色，细胞染色结果较好，数目较多，但是该视野下细胞较乱，没有完整拍出细胞骨架。图中细胞为同组同学林诗颖骨架染色的细胞。结果分析：如图1所示，细胞染色结果很好，但使用荧光显微镜时亮度可能没有调好，中间细胞核亮度太高导致出现光斑，不能清晰观察。细胞生长状况较好。