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1食品科技学院王雪静食品微生物检验技术2一、定义通过一定的实验方法测定食品中的微生物，特别是致病微生物的数量、种类、性质，从而判断食品的卫生质量，保证消费者的身体健康。3二、食品微生物检验的内容菌落总数测定卫生指标菌检验细菌检验大肠菌群数测定致病菌检验霉菌、酵母菌数测定真菌检验产毒霉菌检验霉菌毒素测定4三、食品微生物检验的特点1、具有法规性2、检验的范围广3、杂菌含量多，要检验的菌少。（1）需要增菌（2）抑制杂菌4、检验结果具有数量界限5、需要采样后尽快检验，快出结果四、意义：检出有害微生物，避免食物中毒，避免造成经济损失。5五、食品卫生细菌常规检验项目菌落总数测定大肠菌群测定沙门氏菌检验致病菌志贺氏菌检验金黄色葡萄球菌检验溶血性链球菌检验六、细菌污染食品的途径1、食品加工原料的污染2、产、储、运、销过程中的细菌污染3、从业人员的污染4、食品加工过程中的污染卫生指标菌6第一章食品微生物检验中的生理生化实验设计生化实验的原则：在实验中加入某些化学物质，使细菌代谢途径中分解代谢产物与加入的化学物质发生反应，产生某些变化或出现某种特征。一、过氧化氢酶及过氧化物酶实验原理1、2H2O2过氧化氢酶2H2O+O2阳性2、过氧化物酶：RH2+H2O2过氧化物酶R+2H2O阳性：细菌变为黑褐色；阴性：不变色。阳性阴性7二、细胞色素氧化酶实验原理细胞色素C细胞色素氧化酶氧化型细胞色素C+对苯二胺+--奈酚靛酚兰（蓝色）阳性：2分钟内生成蓝色为阳性；阴性：无变化。阳性阴性8阳性：不抑菌，变混浊阴性：抑菌三、氰化钾实验9四、硝酸盐还原实验原理KNO3还原酶KNO2KNO2+对氨基苯磺酸+-萘胺红色化合物（立刻或数分钟内）五、糖发酵实验分解糖产酸，PH值下降，使培养基的酸碱指示剂发生变化。阳性：产酸产气阴性阳性阴性阳性10六、氧化发酵实验（O/F实验）有些微生物分解葡萄糖必须有氧参加，此种细菌称为氧化型；有些细菌有氧无氧均可分解葡萄糖，称发酵型；有些细菌任何条件都不能分解葡萄糖，称产碱型。阳性阴性灭菌琼脂（厌氧）11七、甲基红实验（MR实验）和V-P实验1、MR实验原理：一些细菌分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸可被进一步分解为甲酸、乙酸、乳酸和琥珀酸而使培养基的PH值下降到4.5以下，加入甲基红指示剂出现红色反应阴性阳性122、V-P实验原理一些细菌分解葡萄糖为丙酮酸，进一步脱羧产生乙酰甲基甲醇，乙酰甲基甲醇在碱性溶液中被空气中的氧氧化成二乙酰丁二酮，进而与培养基内蛋白胨中所含的精氨酸的胍基发生反应生成红色化合物。（实验结果同MR实验）八、柠檬酸盐实验（枸橼酸盐实验）一些微生物可以以铵盐作为唯一的氮源，以柠檬酸盐作为唯一的碳源，在柠檬酸盐培养基上生长，分解柠檬酸盐生成碳酸盐，使培养基变成碱性，酸碱指示剂变色。阴性阳性13九、丙二酸钠实验一些微生物可以以丙二酸钠作为唯一碳源，分解丙二酸钠生成碳酸钠，使培养基变成碱性，酸碱指示剂变色。十、马尿酸盐实验一些细菌可以水解马尿酸生成苯甲酸和甘氨酸，苯甲酸和Fe3+反应生成有色的苯甲酸盐沉淀。阴性阳性阳性14十一、明胶液化实验一些细菌可产生胞外酶，使明胶蛋白分解为氨基酸,而失去明胶的凝固能力。十二、苯丙氨酸脱氨酶实验一些细菌有苯丙氨酸脱氨酶，可以脱氨生成苯丙酮酸，其与FeCl3反应产生绿色。15十三、氨基酸脱羧酶实验一些细菌可以产生氨基酸脱羧酶使氨基酸脱酸，产生胺类物质，使培养基变碱，酸碱指示剂变色。十四、尿素实验一些细菌可以产生尿素酶，使尿素分解产生大量的胺，使培养基变碱，培养基指示剂变色。阳性阴性阳性16十五、靛基质实验（吲哚实验）一些细菌可以分解蛋白胨的色氨酸，产生靛基质，靛基质可与对二甲氨基苯甲醛作用，生成玫瑰吲哚而成红色。十六、ONPG实验（检测-半乳糖苷酶）邻硝基酚----D半乳糖苷-半乳糖苷酶邻硝基酚+--D半乳糖阳性对照阳性17十七、淀粉酶实验一些细菌可产生淀粉酶将淀粉分解为双糖或单糖，加入碘不变色。十八、卵磷脂酶实验一些细菌产生卵磷脂酶，可以分解卵磷脂产生甘油脂和水溶性的磷酸胆碱，在菌落周围形成一个乳白色的沉淀或浑浊带。接种菌，可产生淀粉酶乳白色浑浊带透明圈18十八、脱氢酶实验微生物有脱氢酶，可使氯化三苯四氮唑（TTC)还原，由无色变为红色。十九、三糖铁实验1、成分：牛肉膏、蛋白胨（氮源）三糖：葡萄糖0.1%、乳糖1%、蔗糖1%硫酸亚铁琼脂培养基摆成高层斜面PH值调到7.4阳性19黄PH6指示剂酚红砖红色PH=7(大约）红色PH72、接种（1）穿刺接种（2）斜面划线接种36oC培养18--24小时3、观察结果（1）分解葡萄糖、乳糖、蔗糖：斜面产酸变为黄色（阳性），底层产酸变为黄色（阳性）20（2）分解乳糖、蔗糖，不分解葡萄糖：斜面、底层都产酸变为黄色（阳性）（3）分解葡萄糖、不分解乳糖、蔗糖：斜面：产碱显红色（阴性）底层：产酸显黄色（阳性）（4）分解含硫氨基酸产硫化氢硫化氢与Fe2+生成黑色沉淀，培养基变黑（FeS）（5）分解糖类产气，培养基中有气泡。21二十一、硫化氢实验一些微生物分解含硫氨基酸（胱氨酸或半胱氨酸），产生硫化氢硫化氢与二价铁盐或铅盐生成黑色沉淀，使培养基变黑。（1）（2）（3）22第二章血清学实验一、抗原、抗体抗原：能在体内引起免疫反应的物质抗体：抗原刺激产生的物质二、血清学试验抗原与抗体在体外发生的特异性结合反应叫血清学试验玻片凝集实验Ag+AbAg+生理盐水（对照）23三、血清学实验在食品微生物检验中的应用1、血清型：是根据微生物抗原构造的不同，对微生物进行分类的一种名词2、在医学检验中可以用已知的抗原测定未知的抗体，也可用用已知的抗体测定未知的抗原。3、在食品微生物检验中用已知的抗体测定未知的抗原。24第三章样品的采集处理及送检一、样品的种类大样：一整批样品（数量不固定）。中样：从大样的不同部位取得的混合样品。小样：从中样取的、供检验用的样品。二、采样原则：所采集的样品必须有代表性。在采样前应对食品的原料加工方法运输保藏条件及销售中的各个环节等进行调查。在调查的基础上采集有代表性的样品。三、采样注意事项1、在无菌操作下进行。2、采样用具必须是无菌的。3、所用容器不得含有任何消毒剂、防腐剂抗生素等杀菌或抑菌物质。254、据样品的种类如袋、瓶、罐装者，应采取完整未开封的，若样品包装过大，则用无菌采样器采样。样品为固体粉沫，应边取边混合；为液体，振摇均匀后再取样；为冷冻食品，采样后应保持在冷冻状态；非冷冻食品采样后，应保持在0--5oC（不能冷冻）.5、按规定采样数量及方法采集样品量。6、样品采集后贴好标签、标明品名、来源、数量、地点、采样者及年月日等必要时可贴封条送检。7、记录采样现场的温度、湿度及卫生状况。四、样品的处理1、固体样品：用灭菌刀、剪、镊子，取不同部位25克，剪碎，放入灭菌均质器内或乳钵内，加定量灭菌生理盐水，研碎混匀，制成1：10混悬液。不同食品混悬液制法不同：一般食品取25克，加225克26灭菌生理盐水使其溶解即可；含盐量较高的食品直接解在灭菌蒸馏水中；在室温下较难溶解的食品如奶粉、奶油、奶酪、糖果等样品应先将盐水加热到45oC后放入样品（不能高于45oC），促使其溶解；蛋制品可在稀释液瓶中加入少许玻璃珠，振荡使其溶解；生肉及内脏应先将样品放入沸水内煮3--5秒或灼烧表面进行表面灭菌，再用灭菌剪刀剪掉表层，取深度样品25克，剪碎或研碎制成混悬液。2、液体样品1）原包装样品将液体混匀后，用点燃的酒精棉球对瓶口进行消毒灭菌，用石炭酸或来苏儿（煤酚皂液）等浸泡过的纱布盖好瓶口，再用消毒开瓶器开启后直接吸取进行检验。2）含CO2的液体样品（如汽水、啤酒等）可用上述无菌27方法开启瓶盖后，将样品倒入无菌磨口瓶中，盖上一块消毒纱布，开一缝隙轻轻摇动，使气体溢出后再进行检验。3）酸性液体食品：按上述无菌操作倒入无菌容器内，再用20%的Na2CO3调节PH值为中性后检验。3、冷冻食品1）冰棍儿：用灭菌镊子除去包装纸，将3支冰棍放入灭菌磨口瓶中，棍留在瓶外，用盖压紧用力将棍抽出或用灭菌剪刀剪掉棍，放45oC水浴30分钟溶化后立即检验。2）冰淇淋：用灭菌勺取出后放入灭菌容器内，待其溶化后检验。3）冰蛋：将装有冰蛋的磨口瓶放入流动的冷水中，溶化后充分混匀检验。284、罐头对罐头先进行密封实验及膨胀实验，观察是否有漏气或膨胀情况。若进行微生物检验，先用酒精棉球擦去油污，然后用点燃的酒精棉球消毒罐口，用来苏水浸泡过的纱布盖上，再用灭菌的开罐器打开罐头，除去表面，用灭菌勺或吸管取出中间样品进行检验。5、调查现场的棉试子涂擦实验将涂擦过的棉试子放在定量灭菌生理盐水中，在检验前用力振荡约50次后再进行接种培养。大小分5cm2、1cm2等（规板）29五、样品的送检样品送到微生物检验室应越快越好，一般不超过3h如果路途遥远，可将不需冷冻的样品保持在1--5oC环境中（如冰壶）。如需保持冷冻状态，则需保存在泡沫塑料隔热箱内（箱内有干冰可维持在0oC以下）。30第四章卫生指标菌检验第一节菌落总数测定一、定义：是指食品检样经过处理，在一定条件下培养后，所得1克或1毫升检样中所含细菌菌落的总数。二、原理：样品经稀释后，使样品悬液中的微生物分散存在，接种一定量到培养基中，充分混匀。从理论上来说微生物在培养基中分散呈单个存在，一个菌体长出一个肉眼可见的菌落，计算菌落数可推出菌体数。31菌落总数测定方法规定的培养条件下所得结果，只包括一群在营养琼脂上生长发育的嗜中温性需氧的菌落。菌落总数主要作为判定食品被污染程度的标志，也可用于观察细菌在食品中繁殖的动态，从而对被检样品进行卫生学评价提供依据。32三、检验程序：检样作成几个适当倍数的稀释液选择2-3个适宜稀释度各以1毫升量加入灭菌平皿内每皿内加入适量琼脂菌落计数报告36±1oC48±2h33四、检验方法（P6）五、菌落总数测定时的注意事项：1、固体样品应彻底粉碎；2、培养基（营养）琼脂必须透明、无杂质；3、选择好稀释度；4、培养基温度应在46oC，不能过烫，否则易把细菌烫死；5、培养液中接种菌悬液后，应在半小时内接种培养基，（时间太长，某些细菌可自动凝集）培养基和菌悬液必须充分浑匀。34第二节大肠菌群数测定一、定义大肠菌群系指一群在37oC24h能发酵乳糖、产酸、产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。该菌主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，具有广泛的卫生学意义。食品中大肠菌群数系以每100毫升（克）检样内大肠菌群最可能数（MPN）表示。二、选择粪便污染指标菌应具备的条件：1、这种菌在人和温血动物中普遍存在，且数量较多；2、在水和食品中生存时间与肠道致病菌相当或稍长；3、在粪便污染的水和食品中容易找到，未污染的水和食品中不能发现；354、对氯的低抗力与肠道致病菌相似；5、检验方法比较简单，易于检出。三、大肠菌群数测定的卫生学意义：大肠菌群包括：艾希氏菌属、肠杆菌属、柠檬酸杆菌属、克雷伯氏菌属新鲜粪便中艾希氏菌属占优势。1、大肠菌群作为粪便污染指标菌，既包括近期污染又包括远期污染，具有广泛的卫生学意义，对人的安全保险系数更大了；2、测定大肠菌群含量表明食品被粪便污染的程度：如果菌数含量越多，表明粪便污染越严重，并间接表示有肠道致病菌污染的可能性。四、大肠菌群数测定原理36三步九管法：1、乳糖发酵实验（初发酵实验）培养基：乳糖胆盐培养基（液体）指示剂：溴甲酚紫2、平板分离培养基：伊红美蓝（EMB）（固体）酸性条件伊红和美蓝反应生成深紫色带金属光泽的物质3、证实实验（复发酵实验）乳糖发酵管37五、检验程序（P10）六、检验方法（P10）38总结：提高大肠菌群检出率的措施：1、小于30的液体样品，取原液10ml、1ml和1：10稀释液1ml接种。2、若小管中无气泡应轻轻振摇试管，若有气泡上升也算产气。3、平板上深紫色带金属光泽的和深紫色的菌落都是典型菌落；若没有典型的菌落，红色、粉色菌落也是可疑菌落。4、若平板上无典型菌落，应挑选3--5个红色或粉色的革兰氏阴性无芽孢杆菌菌落混合接种于乳糖发