仪器分析讲稿(第3章液相)-3

08级仪器分析教程（2009-2010学年)InstrumentalAnalytical仪器分析第三章高效液相色谱分析（HPLC）§3.1高效液相色谱的特点一、定义：液相色谱法是指流动相为液体的色谱技术。高效液相色谱是20世纪70年代急剧发展起来的一项高效、快速的分离技术。（液相色谱+气相色谱理论+高压泵、高效固定相+高灵敏检测器）。二、特点1.高压:可达150～350×105Pa2.高速:例，分离20种氨基酸，经典色谱法要20多小时，用HPLC只需1小时.3.高效：3万塔板/米（GC2000塔板/米）4.高灵敏度：紫外检测器10-9g；荧光检测器10-11g08级仪器分析教程（2009-2010学年)InstrumentalAnalytical仪器分析三、应用范围气相色谱仅能分析在操作温度下能气化而不分解的物质。对高沸点化合物、非挥发性物质、热不稳定化合物、离子型化合物及高聚物的分离、分析较为困难。致使其应用受到一定程度的限制，据统计只有大约20%的有机物能用气相色谱分析；而液相色谱则不受样品挥发度和热稳定性的限制，它非常适合分子量较大、难气化、不易挥发或对热敏感的物质、离子型化合物及高聚物的分离分析，大约占有机物的70-80%。。因此，高效液相色谱法，只要求试样能制成溶液，而不需要气化，不受试样挥发性的限制。08级仪器分析教程（2009-2010学年)InstrumentalAnalytical仪器分析§3.2影响色谱峰扩展及色谱分离的因素与GC比较65/1；基本概念及理论基础与GC一致；主要区别：流动相不同.液相色谱中对色谱峰扩展及色谱分离影响的因素：一、柱内展宽1.涡流扩散项：He=2λdpλ:填充不均匀因子；dp填充粒度直径高效液相色谱法的固定相是高效填料，其颗粒直径比气相色谱法更小；且装柱多采用匀浆法装柱，填充很均匀，λ变得很小，所以He值比较小。08级仪器分析教程（2009-2010学年)InstrumentalAnalytical仪器分析2.纵向扩散项65/-1：Hd=CdDm/u；当试样分子在色谱柱内被流动相带向前时，由于分子本身运动所引起的纵向扩散同样引致色谱峰的扩展。由于分子在液体中的扩散系数Dm比在气体中小4-5个数量级，在LC中可忽略,GC中重要。08级仪器分析教程（2009-2010学年)InstrumentalAnalytical仪器分析08级仪器分析教程（2009-2010学年)InstrumentalAnalytical仪器分析3、传质阻力项组分分子在固定相与流动相之间传质缓慢引起局部不平衡，从而引起峰扩展。（1）固定相传质阻力项（主要发生在液－液分配色谱中）当流动相中的试样分子扩散进入到涂渍在载体表面的固定液内进行质量交换时，由于渗入固定液膜的深度不同，其返回到流动相中的时间也不同，因而引起峰扩展。扩散系数。试样分子在固定液内的固定液的液膜厚度。。容量因子）有关的系数是与式中sfssfssdkDdCHD(C)33(208级仪器分析教程（2009-2010学年)InstrumentalAnalytical仪器分析•采取措施：•1）液-液分配色谱：薄的固定相层；吸附、排阻、离子交换色谱：小的颗粒填料。•2）采用扩散系数大的液相固定相。•3）减小流动相的流速，改善传质。08级仪器分析教程（2009-2010学年)InstrumentalAnalytical仪器分析（2）流动相传质阻力项(二种形式:在流动的流动相中的传质和滞留的流动相中的传质)i.流动的流动相中的传质阻力项Hm当流动相流经色谱柱内的填充物时，靠近填充物颗粒表面的流速较慢，而流路通道中心的流速则较快，移动速度不一样从而引起峰形变宽。.D(C)43(2流动相线速度扩散系数。试样分子在流动相中的固定相的粒度。容量因子）函数。是与式中udkuDdCHmmmmpmm08级仪器分析教程（2009-2010学年)InstrumentalAnalytical仪器分析ii.滞留的流动相中的传质阻力项Hsm由于固定相的多孔性能使流动相滞留在其微孔内，微孔内的流动相称为滞留区流动相（静止状态，不流动）。当流动相中的试样分子与固定相进行质量交换时，必须先从流动相扩散进入到滞留区。如果固定相中微孔既小又深，则滞留就越严重，传质就越慢，对峰扩展影响也越大。.D,C)43(2流动相线速度扩散系数。试样分子在流动相中的固定相的粒度。分数及容量因子有关。相所占据部分的它与颗粒微孔中被流动是一常数式中uduDdCHmmsmmpmssm08级仪器分析教程（2009-2010学年)InstrumentalAnalytical仪器分析由于柱内色谱峰扩展所引起的塔板高度的变化可归纳为：H=A+B/u+Cu由于B/u这一项可以忽略不计，影响柱效的主要因素是传质阻力项，高效液相色谱的方程可写成：H=A+Cu提高柱效的方法：（1）减小固定相的颗直径，可明显提高柱效；（2）降低流动相粘度或提高柱温，可增大Dm；（3）在一定范围内减小流速，有利于于减小H；（4）提高装柱技术，提高柱内填充料的均匀性而减小A项。)63()(2:222uDdCDdCDdCudCdHsfsmpmsmpmmdp板高度的总变化色谱峰扩展所引起的塔08级仪器分析教程（2009-2010学年)InstrumentalAnalytical仪器分析1.固定相与装柱方法的选择：选粒径小的、分布均匀的球形固定相（dp≤10μm,5μm目前应用最广泛）首选化学键合相，匀浆法装柱2.流动相及其流速的选择：选粘度小、低流速的流动相——甲醇，约1ml/min3.柱温的选择：选室温25℃左右HPLC法中分离条件的选择08级仪器分析教程（2009-2010学年)InstrumentalAnalytical仪器分析HPLC与GC的H-u曲线见图3-1：（1）两者曲线形状相似，都有一个H最小值；（2）HPLC的H最小值比GC的最小值小一个数量级以上，柱效更高；（3）HPLC的最佳流速u比GC的最佳流速u也小一个数量级以上。08级仪器分析教程（2009-2010学年)InstrumentalAnalytical仪器分析二、柱外展宽：指色谱柱外各种因素引起的峰扩展.a.柱前展宽：主要由进样所引起；•进样方式：将试样注入色谱柱的顶端滤塞上或注入进样器的液流中。•由于进样器的死体积以及进样时的液流扰动引起色谱峰不对称和展宽。•解决：试样注入柱顶端中心点或填料中心1~2mm处。b.柱后展宽：主要由接管、检测器流通池体积所引起.•解决：连接管的体积、检测器的死体积应尽可能小.08级仪器分析教程（2009-2010学年)InstrumentalAnalytical仪器分析§3.3高效液相色谱的主要类型及其分离原理类型：液-液色谱；液-固色谱；离子交换色谱；离子对色谱；离子色谱；空间排阻色谱08级仪器分析教程（2009-2010学年)InstrumentalAnalytical仪器分析一.液-液分配色谱法及化合键合相色谱1.特点：a.流动相和固定相都是液体b.两相应互不相溶，有明显的分界面2.分离机制：试样组分溶于流动相后,在固定相和流动相之间的相对溶解度存在差异，溶质在两相间进行分配。K=cs/cm=kVm/Vs分离的顺序决定于分配系数的大小，分配系数大的组分保留值大.而且流动相的种类对分配系数有较大的影响.08级仪器分析教程（2009-2010学年)InstrumentalAnalytical仪器分析3.解决固定液流失问题方法：1)采用正或反相色谱a.正相液-液色谱法：流动相的极性小于固定液的极性（流疏固亲；适用于分离极性物质）b.反相液-液色谱法：流动相的极性大于固定液的极性（流亲固疏；适用于分离非极性物质）2)采用化学键合固定相化学键合固定相：将固定相上的各种不同有机基团通过化学反应共价键合到硅胶（担体）表面的游离羟基上，形成化学键合固定相.•目前反相键合相色谱法，已成为高效液相色谱中应用最广泛的一个分支。08级仪器分析教程（2009-2010学年)InstrumentalAnalytical仪器分析二.液-固色谱法（或液-固吸附色谱法）1.特点：流动相为液体，固定相为吸附剂。2.分离机制：根据物质吸附作用的不同来进行分离。吸附作用大即分配系数大的组分，吸附剂对它的吸附力强，保留值就大,出峰晚，后出来.3.作用：a.适用分离相对分子质量中等油性试样。b.对具有不同官能团的化合物和异构体有较高的选择性。缺点：由于非线性等温吸附常引起峰的拖尾现象.08级仪器分析教程（2009-2010学年)InstrumentalAnalytical仪器分析三、离子对色谱法1.特点：离子对色谱法对各种强极性的有机酸或有机碱的分离，分离效能高，分析速度快，操作简便.2.分离机制：将一种或多种与溶质电荷相反的离子（称为对离子或反离子）加到流动相或固定相中，使其与溶质离子结合形成疏水型离子对化合物，从而控制溶质离子的保留行为。X+水相+Y－水相↔X+Y－有机相•试样离子X＋进入柱内以后，与对离子Y－生成疏水性离子对X＋Y－，后者在疏水性固定相表面分配或吸附。08级仪器分析教程（2009-2010学年)InstrumentalAnalytical仪器分析•3.离子对色谱法分类•正相离子对色谱法(极性固定相，非常性流动相）•反相离子对色谱法（非极性固定相，极性流动相v如含有对离子Y－的甲醇－水（或乙腈－水）溶液）。)133()1.].[1()121(1.].[.水相水相YKuLtYKVVDkXYRXYMSx可见保留值随KXY和[Y-]水相的增大而增大。08级仪器分析教程（2009-2010学年)InstrumentalAnalytical仪器分析4.应用：解决了以往难分离混合物的分离问题.•如酸、碱和离子、非离子的混合物，特别是一些生化试样如核酸、核苷、儿茶酚胺、生物碱及药物的分离了。•还可借助离子对的生成给试样引入紫外吸收或发荧光的基团，提高检测的灵敏度。08级仪器分析教程（2009-2010学年)InstrumentalAnalytical仪器分析四.离子交换色谱法1.分离机制70/2；离子交换树脂上可电离的离子与流动相中具有相同电荷的溶质离子进行可逆交换，依据这些离子对交换剂具有不同的亲和力而将它们分离。)83(()73(N3NM443树脂）＋（树脂）＋阴离子交换：树脂）＋（树脂）＋（阳离子交换：＋＋NRXClNRClXSOMaSOa08级仪器分析教程（2009-2010学年)InstrumentalAnalytical仪器分析3.a.分配系数D愈大，表示溶质的离子与离子交换剂的相互作用愈强。b.亲合力高的，在柱中保留值就愈大.4.应用：a.凡在溶剂中能够解离的物质。b.已成功地分离氨基酸、核酸、蛋白质等.08级仪器分析教程（2009-2010学年)InstrumentalAnalytical仪器分析五、离子色谱法1.构成：固定相:离子交换树脂流动相:电解质溶液检测器:电导检测器主配件：抑制柱（抑制流动相中强电解质背景离子的干扰）。2.流程图：fig3-208级仪器分析教程（2009-2010学年)InstrumentalAnalytical仪器分析双柱型原理：离子交换原理(以分离阴离子为例）。1)分离柱：离子交换(阴离子交换剂）R—OH－＋+Na+Br-(待测)→R—Br-+Na+OH-（交换）R—Br-＋+Na+OH－(洗脱剂)→R—OH-+Na+Br-（洗脱）2)抑制柱:消除本底电导影响（阳离子交换剂）R—H＋+Na+OH-(流动相)→R—Na++H2OR—H＋+Na+Br-(流动相)→R—Na++H+Br-•洗脱液(NaOH)转化为低电导的水，消除本底电导影响；待测离子(Br-)转化为具有更大淌度的酸(HBr)，提高检测灵敏度。08级仪器分析教程（2009-2010学年)InstrumentalAnalytical仪器分析•a.双柱型：化学抑制型离子色谱法（高电导洗