医学微生物学实验课件

1.通过介绍实验室生物安全方面的相关知识，树立“有菌的意识，无菌操作的观念”。2.掌握革兰染色方法和细菌接种技术。3.观察细菌的特殊结构。实验目的生物危害源化学危害源物理危害源后两者的特性：1、可感知，易避免2、危害范围有限3、危害持续时间短一.实验室生物安全医学实验室的主要危害源包括哪些?惨痛的历史教训例一：1956年，前苏联的一个实验室曾有9支装有感染了委内瑞拉马脑炎病毒的鼠脑的安瓿被打破。由于没采取必要的措施，结果在几天内造成24名工作人员感染。一.实验室生物安全例二：2004年4月，中国疾病预防控制中心科研人员，采用未经论证的非典病毒灭活方法，在不符合防护要求的普通实验室内操作非典感染材料，造成北京、安徽发生非典疫情。一.实验室生物安全例三：2010年12月东北农业大学“羊活体解剖学实验”，共5个班级28人感染布鲁氏菌病。采购人均未要求养殖场出具检疫合格证明，断定未经检验的这4只山羊带有布鲁氏菌。此外，导致此次感染的原因还有:未能切实按照实验规范，严格要求学生遵守操作章程，进行有效防护。一.实验室生物安全实验室感染的事件曾多次发生，实验室人员曾为此付出了沉重的代价。这些感染的主要原因是：防护意识不强，操作失误，防护条件不足。一.实验室生物安全医学微生物学实验室规则学生进微生物实验室必须穿好工作服，离室需脱下反折，要经常清洗消毒。进实验室时随带书包、衣物等与实验无关物品一律存放指定的储物柜内。严禁在实验室进食、饮水和喧哗打闹。手拿培养物后或出实验室前要洗手，必要时用消毒液泡手；避免有菌材料溅出；破损器材及时处理并报告。实验过程中避免一切不良的个人习惯；操作中产生的废料要扔在指定容器内；实验完毕清理台面，值日生严格认真打扫卫生，关闭水电，门窗，洗手后离开实验室。实验室意外紧急处理办法1皮肤破损：去除异物，生理盐水或蒸馏水洗净后2%碘酊或2%红汞涂抹。2烧伤：局部涂凡士林，2%鞣酸或2%苦味酸。3化学药品腐蚀伤：若强酸则先用大量清水冲洗，再用碳酸氢钠溶液洗涤中和；若强碱则先用大量清水冲洗，再用2%硼酸洗涤中和（若伤处为眼部加用橄榄油或者液体石蜡1~2滴滴眼）。4菌液入口：立即吐入消毒容器内，1：1000高锰酸钾或3%双氧水漱口，根据菌种服用抗菌药物。5菌液污染台面：2%~3%来苏尔或0.1%新洁尔灭覆盖30分钟后抹去，皮肤手指沾染活菌应用上述液体浸泡3分后肥皂和清水洗净。6火警：勿慌，立即关闭电闸和煤气闸。若酒精乙醇乙醚等有机溶剂起火切不可用水扑救，可用沙土等物扑灭。二.无菌操作技术实验目的1.掌握常用的细菌接种方法2.熟悉细菌生长现象的观察方法概念：是人工配制的专供微生物生长繁殖的混合营养物制品。成分：充足的营养物质（水分、碳源、氮源、无机盐）；合适的PH；适宜的温度；适宜的气体环境。用途：用于微生物的繁殖及分离接种，传代或保存，鉴别微生物的类属，研究微生物的生理及生化特性等。一、培养基二、培养基分类按用途分营养培养基：血液琼脂培养基基础培养基：普通琼脂培养基选择培养基：S-S培养基鉴别培养基：双糖铁培养基厌氧培养基：庖肉培养基二、培养基分类按物理性状分液体培养基：大量繁殖细菌固体培养基：分离鉴定细菌半固体培养基：观察动力及保存菌种普通固体琼脂培养基接种法1.平板分区划线接种法：分离培养细菌。2.斜面固体培养基接种法：纯菌的移种，短时间保存菌种。半固体琼脂培养基穿刺接种法保存菌种或观察细菌的动力液体培养基接种法用于肉汤、蛋白胨水、糖发酵管等。三、细菌的接种方法1.平板分区划线接种-得单个菌落分区划线注意事项划线时接种环与平皿约成30～40度角,轻轻接触,以腕力在琼脂表面轻快滑动,不能划破琼脂。第一次划线应占平皿面积的1/10,以后每次划线约占面积的1/4～1/5。划线为连续划线,不能间断。应占满平皿。划线不能交叉重复。每次划完后应灭菌。2.斜面接种法3.液体培养基接种法4.半固体培养基穿刺接种法四、细菌生长现象的观察1.固体培养基-菌落单个细菌分裂繁殖形成一堆肉眼可见的细菌集团。观察菌落的形态、大小、表面、边缘、湿度、透明度；在血平板上还要观察溶血情况和色素等。2.半固体培养基-鞭毛观察细菌的动力三.细菌在液体培养基中的生长情况菌膜菌沉淀均匀浑浊对照3.液体培养基混浊生长（大多数细菌）沉淀生长（链球菌）膜样生长（专性需氧菌，如结核分枝杆菌）操作内容1.平板分区划线法。2.斜面培养基的接种方法。3.半固体培养基穿刺接种法。4.液体培养基的接种方法。三.细菌的形态学检查染色标本检查单染法：简单染色，一种染料（美蓝染色）复染法：复杂染色，两种以上染料（革兰染色、抗酸染色）革兰染色(Gramstain)1884年由丹麦细菌学家Gram创立。革兰染色是最常用的一种染色方法，可以将细菌初步分为革兰染色阳性菌和革兰染色阴性菌，在临床上具有非常重要的意义。一、目的1.掌握细菌涂片的制备及革兰染色的方法。2.熟悉革兰染色的原理和临床意义。一一半半结晶紫卢戈氏碘液95%乙醇石碳酸复红初染媒染脱色复染凡能保留第一种染料结晶紫的蓝紫色的细菌叫G+菌，凡能被酒精脱色之后染上复染液石碳酸复红的红色的细菌叫G-菌。G+G-二、原理通透性学说G+菌细胞壁结构致密，肽聚糖层厚且交联度高，脂质含量少，乙醇不易渗入。G-菌细胞壁结构疏松，肽聚糖层薄且交联度低，含大量脂质，乙醇易渗入。等电点学说G+菌等电点（pI2~3）G-菌等电点（pI4~5）在相同pH条件下G+菌所带负电荷比G-菌多，所以与带正电荷的结晶紫染料结合较牢固，不易脱色。三、器材和试剂1.菌种：白色葡萄球菌大肠杆菌2.试剂：革兰染色液初染液结晶紫媒染液卢戈氏碘液脱色液95%乙醇复染液稀释石碳酸复红3.其它：接种环载玻片染色盘洗液瓶酒精灯等冲洗3、使用油镜观察实验结果四、方法与步骤1、细菌涂片的制备涂片干燥固定2、染色初染（结晶紫）媒染（卢戈氏碘液）脱色（95%乙醇）复染（稀释石碳酸复红）吸水纸吸干1min1min30s30s冲洗冲洗冲洗一一半半G+菌G-菌结晶紫卢戈氏碘液95%乙醇石碳酸复红初染媒染脱色复染五、结果图一图二无菌操作（接种环灭菌和取菌）涂片的厚度要适中染色的时间控制，一一半半冲洗的方法，不要对着涂片区冲洗六、注意事项七、意义1、鉴别细菌2、研究与致病性的关系3、指导临床用药G+菌G-菌G+菌：外毒素G-菌：内毒素G+菌：青霉素、头孢菌素等G-菌：链霉素、庆大霉素等细菌的特殊结构（示教）（二毛荚一胞）从细胞质的基础颗粒长出，伸到细胞外面的细长呈波状弯曲的丝状物。功能：鞭毛运动可鉴定、与致病性有关、具有抗原性（H抗原）比鞭毛更细、短、直、硬、多的丝状蛋白附属物，与运动无关，菌毛中空，可分为普通菌毛和性菌毛功能：普通菌毛附黏膜，性菌毛传递遗传物质菌体内部物质缩水（60％）形成圆或卵圆形小体。功能：芽胞形态辨细菌，灭菌标准抗力强。寻找视野：在使用油镜之前，必须先经低、高倍镜观察，然后将需进一步放大的部分移到视野的中心。增大光照强度：将聚光器上升到最高位置，光圈开到最大，凹面镜取光。转高倍镜头、滴加镜油、换油镜头：转动转换器，使高倍镜头离开通光孔，在需观察部位的玻片上滴加一滴香柏油，然后慢慢转动油镜，在转换油镜时，从侧面水平注视镜头与玻片的距离，使镜头浸入油中而又不以压破载玻片为宜。注：油镜的使用方法物镜工作距离(mm)低倍镜10×5.40高倍镜40×0.39油镜头100×0.11