支原体检测验证方案

YCJ制第1页共11页XXXXXXXX项目名称EZ-PCR检测支原体验证方案项目编号起草人日期审核人日期批准人日期YCJ制第2页共11页目录1.概述....................................................................................................................................32.适用范围............................................................................................................................33.验证目的............................................................................................................................34.验证项目............................................................................................................................35.参考文件............................................................................................................................36.验证小组成员及职责........................................................................................................47.验证过程............................................................................................................................47.1.实验材料....................................................................................................................47.2.实验仪器及设备........................................................................................................47.3.专属性验证................................................................................................................47.4.检测限验证................................................................................................................67.5.重现性验证................................................................................................................87.6.耐用性验证................................................................................................................98.验证结果分析..................................................................................................................119.验证评价..........................................................................................................................1110.验证结论..........................................................................................................................11YCJ制第3页共11页1.概述支原体(Mycoplasma)属于柔膜体纲，是介于细菌和病毒之间的一类无细胞壁的原核细胞微生物，是目前所知能在无生命培养基中生长繁殖的最小的微生物。与梭菌属、乳酸杆菌属及链球菌属在进化上相近。支原体是细胞污染物中比较常见的一种，细胞受支原体污染程度较轻时，不会表现出明显的症状，但一旦这种潜伏的污染爆发时，细胞会大量脱落，细胞培养液会变浑浊。原代细胞和传代细胞都可能遭受支原体污染，根据国外不同实验室的调查结果显示，有15%-80%的细胞被支原体污染，传代细胞的污染率高于原代细胞。尽管自然界中存在的支原体有120多种，但污染细胞的支原体主要有5种，分别为牛源的莱氏无胆甾原体和精氨酸支原体，人源的口腔支原体和发酵支原体，猪源的猪鼻支原体，这5种支原体占所有支原体污染的95%以上。支原体污染可能来自操作人员和细胞培养用原材料如血清和胰蛋白酶，也可能来自于本身已被污染的细胞系和毒种。细胞受支原体污染后，功能和活性都会受到影响，会带来不可靠的实验结果和不安全的细胞制品，因此对细胞进行支原体检测实属必要。我国药典第三部明确规定主细胞库、工作细胞库、病毒种子批、对照细胞以及临床治疗用细胞进行支原体检查时，应同时进行培养法和指示细胞培养法（DNA染色法）。直接培养法具有较高的灵敏度，但整个实验所需周期长，指示细胞法相对实验周期短。生物化学法干扰因素较多，ELISA法检测范围有限，因此这两个方法都不能得到普及。在这些方法出现的同时，PCR法得到了发展，PCR因其高敏感性、明确及快捷的特点简化了细胞培养中支原体污染检测过程。BI的EZ-PCR方法检测支原体，检测用的样品仅经过离心分离及悬浮在缓冲液中即可开始PCR反应。琼脂糖凝胶电泳后，阳性模板得到一个270bp的片段，整个过程只需3-4小时。2.适用范围本验证方法适用于BI公司的EZ-PCR支原体污染检测试剂盒检测细胞终制品中支原体污染方法的验证3.验证目的建立细胞终制品的EZ-PCR支原体检测，并对其有效性进行评价，确保试验方法的稳定性，保证试测结果真实可靠。4.验证项目对该方法的专属性、检测限、重现性及耐用性逐一进行验证。5.参考文件《中国药典》2015版3301支原体检查法《中国药典》2015版9201药品微生物检验替代方法验证指导原则《终制品支原体检测标准操作规程》YCJ制第4页共11页6.验证小组成员及职责姓名职责7.验证过程7.1.实验材料7.1.1.菌种：肺炎支原体（ATCC15531株）、口腔支原体（ATCC23714株）、丁酸梭菌、乳酸杆菌、肺炎链球菌。7.1.2.细胞：无支原体污染的Vero细胞。7.1.3.培养基：支原体液体培养基、精氨酸支原体肉汤培养基、支原体半流体培养基、DMEM完全培养基、DMEM无抗生素培养基。7.1.4.试剂：二苯甲酰胺荧光染料工作液、固定液、封片液、SYBR荧光染料等。7.1.5.试剂盒：EZ-PCR支原体污染检测试剂盒、DNA提取试剂盒等。7.1.6.其他：无菌水、Marker、琼脂糖等。7.2.实验仪器及设备PCR仪、电泳仪、离心机、二氧化碳孵箱、超净工作台、荧光显微镜等。7.3.专属性验证7.3.1.定义：专属性是指检测样品中可能存在的特定微生物种类的能力，其专属性验证应确认检测系统中的外来成分不得干扰试验而影响结果。7.3.2.说明：本实验专属性验证采用无支原体污染的Vero细胞代替样品细胞来确认样品细胞DNA的存在是否对检验结果造成影响；用与支原体进化相似的丁酸梭菌、乳酸杆菌、肺炎链球菌代替支原体进行检验，来验证相似微生物的DNA是否对检验结果造成影响。7.3.3.Vero细胞验证：用DNA提取试剂盒提取Vero细胞DNA，过程中注意防止支原体污染，依据EZ-PCR支原体污染检测试剂盒使用说明对提取的DNA进行EZ-PCR扩增，电泳，最后进行凝胶成像，观察结果，在270bp左右是否出现特异性条带。以加入支原体菌株的Vero细胞样品作为样品阳性对照；以上实验做5组平行。结果记录如下表：（原始电泳图见附件一）YCJ制第5页共11页项目编号结果项目编号结果阴性对照1阳性对照1无支原体Vero细胞1支原体阳性Vero细胞122334455实验人/日期审核人/日期注：在“结果”中，270bp左右无条带记录为“—”，有条带记录为“+”。结果说明：当阴性对照为“—”，阳性对照为“+”，实验结果方有效。若“无支原体Vero细胞”结果均为“—”，“支原体阳性Vero细胞”结果均为“+”，则说明样品细胞DNA的存在不会对检验结果造成影响，若结果有异，则需重新验证。7.3.4.相似菌株验证：用试剂盒分别提取丁酸梭菌、乳酸杆菌、肺炎链球菌DNA，方法同Vero细胞验证，每个样品做5组平行，结果记录如下：（原始电泳图见附件二）项目编号结果项目编号结果阴性对照1阳性对照1丁酸梭菌1乳酸杆菌122334455肺炎链球菌1口腔支原体122334455实验人/日期审核人/日期注：在“结果”中，270bp左右无条带记录为“—”，有条带记录为“+”。结果说明：当阴性对照为“—”，阳性对照为“+”，实验结果方有效。若“丁酸梭菌”“乳酸杆菌”“肺炎链球菌”结果均为“—”，“口腔支原体”结果均为“+”，则说明与支原体类似菌株不会对检验结果造成影响，若结果有异，则需重新验证。YCJ制第6页共11页7.4.检测限验证7.4.1.定义：检测限是指在替代方法设定的检验条件下，样品中能被检出的微生物的最低数量。7.4.2.说明：检测限确定的方法是在有样品中接种较低浓度的支原体（每单位不超过5CFU），然后分别采用药典直接培养法、指示细胞培养法和EZ-PCR法对支原体进行检验，以检出与否来比较药典种方法与EZ-PCR方法的差异，最后采用卡方检验（χ2）来评价这些方法的检测限是否存在差异。7.4.3.方法：将肺炎支原体和口腔支原体分别接种于适宜的培养基中，经36℃±1℃培养至培养基变色，盲传两代后，将培养物进行10倍稀释，肺炎支原体取10-7、10-8、10-9、10-10梯度菌液，口腔支原体取10-3、10-4、10-5、10-6梯度菌液。制成待测供试品。两种菌株每个梯度各取1ml菌液分别进行直接培养、指示细胞培养和EZ-PCR,每个培养做三组平行，结果记录如下：（原始记录见附件三）菌株梯度直接培养法指示细胞法EZ-PCR肺炎支原体10-710-810-910-10口腔支原体10-310-410-510-6实验人/日期审核人/日期注：对于直接培养法和指示细胞法，“+”表示检查结果为阳性，“—”表示检查结果为阴性；对于EZ-PCR，“+”表示在270bp左右有特异性条带，“—”表示在270bp左右无特异性条带。对结果进行卡方检验分析。7.4.4.直接培养法操作步骤7.4.4.1.支原体培养基灵敏度检查7.4.4.1.1.操作：将肺炎支原体、口腔支原体接种于适宜的支原体培养基中，经36℃±1℃培养至培养基变色，盲传两代后，将培养物接种至待检培养基中