miRNA-靶基因3’UTR-质粒载体使用说明

miRNA靶基因3’UTR质粒载体使用说明RN：R10032.3产品简介miRNA是一类具有调控功能的非编码小RNA，主要通过与靶基因mRNA3’UTR完全或不完全互补配对而调控靶基因的表达。pmiR-RB-Report™载体是专门用来检测miRNA作用的检测工具，将基因的3’UTR区克隆至载体海肾荧光素酶基因(hRluc)下游位点，以海肾荧光素酶基因作为报告基因，以萤火虫荧光素酶基因(hLuc)作为内参基因，通过检测海肾荧光素酶活性的相对变化情况来鉴定miRNA对该基因是否有调控作用。载体图谱hRluc：海肾荧光素酶基因，为报告基因；hLuc+：萤火虫荧光素酶基因，为内参基因；3’UTRRegion：多克隆位点，基因3’UTR连接位点；Ampr：氨苄青霉素抗性，用于大肠杆菌筛选。试剂（Regent）浓度体积每管含量总含量pmiR-RB-Report™Species-GeneName~100ng/μl~50μl~5μg~10μg注：质粒可以直接用来实验，甘油菌可以进行质粒扩大提取。运输保存产品一般以液体的形式常温运输。收到产品后，请将载体及甘油菌于-20℃以下保存。质粒可以直接用于实验，甘油菌可直接进行质粒扩大提取。实验方法质粒转化转化菌株培养菌种保存（15%甘油菌）质粒提取细胞转染质粒扩增荧光检测图2pmiR-RB-ReportTM质粒载体使用方法图1pmiR-RB-ReportTM载体图谱简图细胞转染为了降低由于细胞密度、转染效率、试剂用量等因素导致的孔间差异，保证实验的可靠性和可重复性，一般建议：a.转染实验中每个转染样品至少设置3个复孔；b.接种细胞时，每孔接种的细胞数量尽量保持一致，并且细胞在各孔的表面平均分布。1.细胞类型与转染试剂：由于实验需要同时转染小分子RNA和质粒载体两种物质，因此，细胞类型、细胞状态和转染试剂是决定实验成败的关键因素，建议选择转染效率较高的细胞系进行实验，如293T，Hela，A549，而转染效率较低的细胞系不适合进行本实验的检测。此外，转染试剂的选择也要考虑到两者共转的实验要求，建议采用适合共转的转染试剂如riboFECT™CP。2.实验设置：miRNA靶基因验证实验最重要的作用是确定miRNA结合位点，通常需要将野生型和突变型质粒载体与miRNA模拟物或抑制物共转，定量检测双荧光素酶的催化产生的荧光数值，鉴定miRNA作用靶点。具体实验设置请参考表1。表1miRNA靶基因验证实验设置参考注：（1）WT：野生型；Mut：突变型；（2）常用miRNAmimic进行miRNA靶基因验证实验，如采用miRNA过表达质粒载体，miRNA过表达病毒载体，使用方法需要客户研究。3.转染浓度：miRNA产品最佳工作浓度因不同的细胞类型及研究目的而异。锐博生物推荐的miRNAmimic转染浓度为50nM，miRNAinhibitor转染浓度为100nM，客户可根据实验具体情况优化转染浓度，优化的范围建议为10~200nM。注：miRNAinhibitor往往需要用到较大的用量才能观察到预期的抑制效果，相当于miRNAmimic的几倍用量，这可能与miRNAinhibitor竞争性抑制的作用机制及作用效率有关。4.转染步骤：以riboFECT™CPReagent共转miRNAmimic和靶基因3’UTR双荧光素酶报告载体质粒于96孔板，转染浓度为50nM为例，其他规格容器转染请参考表2。1）接种细胞a.贴壁细胞：转染前一天，接种1～2×104细胞至含有适量完全培养基的96孔板培养孔中，使转染时的细胞密度能够达到50~80%。注：1）不同细胞生长速度和细胞大小不同，接种细胞的数量需依经验而定；2）每孔接种的细胞数量尽量相同，使细胞均匀分布于培养基表面。b.悬浮细胞：接种1×104~5×104个细胞至含有适量完全培养基的96孔板。2）转染步骤对于每个转染样品，请按以下步骤准备：a.稀释mimic：用7.5μl1XriboFECT™CPBuffer（v1）稀释0.25μl20μMmiRNAmimic储存液（v2）和1μl100ng/μl实验组1实验组2实验组3实验组4质粒载体3’UTRReporter(WT)3’UTRReporter(WT)3’UTRReporter(Mut)3’UTRReporter(Mut)研究工具MimicNcontrolmiRNAmimicMimicNcontrolmiRNAmimic靶基因3’UTR双荧光素酶报告载体质粒（v3），轻轻混匀，室温孵育5min。b.混合液制备：加入0.75μlriboFECT™CPReagent（v4），轻轻吹打混匀，室温孵育0～15min。注：1）请不要振荡，溶液可能会有浑浊，但不会影响转染；2）混合液可室温放置一段时间，但不宜超过24h。c.将riboFECT™CP混合液加入到90.50μl细胞培养基（v5）中，轻轻混匀。注：混合液加入原细胞培养基，无需移除或更换。d.（可选）进行其他必要的特殊处理（如加药处理）。e.将培养板置于37℃的CO2培养箱中培养24~96h（培养时间与实验目的相关）。表2使用riboFECT™CP转染miRNAmimic用量参考v1:riboFECT™CPBuffer(1X)；v2:20μMmiRNAmimic；v3:3’UTR报告质粒；v4:riboFECT™CPReagent；v5:细胞培养基mimic终浓度每孔体积Buffer(v1)mimic(v2)报告质粒(v3)†Reagent(v4)培养基(v5)96-well100nM100μl7.5μl0.5μl1μl0.75μl90.25μl*50nM100μl7.5μl0.25μl1μl0.75μl90.50μl30nM100μl7.5μl0.15μl1μl0.75μl90.60μl20nM100μl7.5μl0.1μl1μl0.75μl90.65μl10nM100μl7.5μl0.05μl1μl0.75μl90.70μl24-well100nM500μl30μl2.5μl5μl3μl459.50μl50nM500μl30μl1.25μl5μl3μl460.75μl30nM500μl30μl0.75μl5μl3μl461.25μl20nM500μl30μl0.5μl5μl3μl461.50μl10nM500μl30μl0.25μl5μl3μl461.75μl12-well100nM1ml60μl5μl10μl6μl919.00μl50nM1ml60μl2.5μl10μl6μl921.50μl30nM1ml60μl1.5μl10μl6μl922.50μl20nM1ml60μl1μl10μl6μl923.00μl10nM1ml60μl0.5μl10μl6μl923.50μl6-well100nM2ml150μl12.5μl25μl15μl1797.50μl50nM2ml150μl6.25μl25μl15μl1803.75μl30nM2ml150μl3.75μl25μl15μl1806.25μl20nM2ml150μl2.5μl25μl15μl1807.50μl10nM2ml150μl1.25μl25μl15μl1808.75μl注：1）*为实验参考用量，对于部分细胞类型需要进一步优化；2）†转染质粒用力以100ng/μl浓度计算，可优化。5.Luciferase荧光测定：1）设备与试剂：a.荧光照度计或多功能酶标仪；b.Dual-Gloluciferaseassaysystem（Promage）或其他兼容试剂。2）检测步骤：转染完成后24~48小时均可进行miRNA效果检测，最佳检测时间与使用的细胞类型有关，可通过分时检测来优化，具体使用步骤请参考Promega的说明书。a.将试剂盒的luciferase底物与luciferasebuffer混合后分装，-80℃贮存，使用前平衡至室温，stop&Globuffer分装后-80℃贮存，使用前平衡至室温并取适量加入stop&Glo底物，现配现用；b.取出待检测的培养板，吸去培养基，加入75μl/well新鲜培养基，并加入75μl/well配置好的luciferase底物，涡旋振荡10min，以仪器如荧光照度计测定荧光值（hLuc荧光值）；c.加入配置好的75μlstopregent，振荡10min，以仪器如荧光照度计测定荧光值（hRluc荧光值）。3）数据分析：将各孔hRluc的荧光值与hLuc的荧光值比较，将比值与对照孔的比值进行统计分析。以表1的实验设置为例，结果如下图所示，统计过程中需以实验组1为参照，分析实验组2的变化，以判断miRNA对靶基因是否有影响。同时以实验组3为参照，分析实验组4的影响，以判断预测的结合位点突变是否会改变miRNA的作用。图3BCL2双荧光素酶检测实验结果示例实验FAQ1）客户特殊实验细胞系转染siRNA效果还可以，是否可以用来做这个实验？答：不能确定，需要鉴定该细胞系是否适合RNA与3’UTR质粒共转，可通过riboMONITOR™来进行转染效率测定实验。2）是否可以不设置突变组，而以空载作为对照？答：如果需要确定miRNA结合位点，则必须设置突变组，空载对照不能说明问题。3）实验结果中荧光值很低，内参荧光的荧光值只有几百，甚至几十，是什么原因？答：可能质粒转染效果差或表达效果差，没有表达内参荧光。建议优化转染条件，或更换细胞系进行实验。另外也需检测仪器相关，不同的检测仪器的荧光值定量方式不完全一样，需要具体问题具体分析。