miRNA的研究策略

miRNA的研究策略GuangzhouGuangzhouRiboBioRiboBioCO.,LtdCO.,Ltd聂忠清聂忠清2010.092010.09主要内容miRNA简介miRNA研究特点锐博生物miRNA研究策略锐博生物miRNA产品与服务miRNA简介2008LaskertomiRNAfounder1993Lin-4，？miRNA的结构Lauetal.,2001miRNA生成和作用通路Garzonetal，2009miRNA功能细胞的生长，增殖，分化，凋亡器官的建成生物个体的发育，繁殖与人类重大疾病相关miRNA与siRNA的区别miRNAsiRNA存在形式miRNA基因存在与多种物种的基因组中；无特定的siRNA基因；成熟过程核内加工过程有Drosha类蛋白的参与无Drosha类蛋白参与加工存在初级前体pri-miRNA及前体pre-miRNA无前体形式存在功能形成miRISC沉默复合体；形成siRISC沉默复合体；与靶mRNA不完全互补或完全互补都能作用；与靶mRNA完全互补，单碱基的突变会影响干扰效果；抑制mRNA翻译或者促进mRNA降解，该过程可能有P-body这样的特殊结构参与；降解靶mRNA，尚未发现其他特定结构体的参与；微调蛋白的表达；近完全抑制蛋白的表达；预测30%的基因直接受miRNA调节，单miRNA调控多个靶基因，多个miRNA调控单个靶基因，网络调控每一个mRNA均可设计出siRNA，除非靶位点在同源基因的保守区，否则特异性强。miRNA相关数据库miRNA序列数据库miRbase：Homosapiens[GRCh37](940)Mouse：Musmusculus[NCBIM37](590)Rat：Rattusnorvegicus[RGSC3.4](326)靶点预测：picTar、TargetScan、miRDB等miRGenGenomics:miRNA在基因中的位置Targets:联合多个常用预测软件Cluster:指定长度的miRNAcluster综合数据库名称/参考文献主要用途网址miRBaseGriffiths-Jonesetal.,2008miRNA序列注册，靶点预测，并提供序列信息基因组信息，靶点预测，miRNA簇预测收集实验验证的靶点来源，表达，功能收集不同物种miRNA，表达及靶点信息靶点预测及miRNA表达预测，靶点预测，miRNA启动子预测表达谱数据收集靶位点的多态性所在的信号通路靶点预测及miRNA及靶基因功能注释在人类疾病中差异表达的miRNA数据库基因定位、表达研究发展趋势—drugmiRNA研究特点miRNA研究流程特点寻找miRNA寻找miRNA靶点miRNA靶点验证验证miRNA与生物表型的关系1.文献报道2.表达谱筛选3.功能筛选1.靶点预测：picTar、TargetScan1.mRNA水平2.蛋白水平3.报告基因4.生物表型1.细胞水平2.模型动物水平3.人体组织样本miRNA研究领域特点940个miRNA细胞组织器官干细胞生殖疾病：肿瘤心脑血管疾病神经疾病整体miRNA研究领域分布miRNA功能研究（miRNA-靶点-细胞表型）miRNA与信号通路的关系（miRNA-靶点-信号通路）miRNA与重要基因的关系（靶基因-miRNA）miRNA与干细胞（miRNA-靶点-干细胞维持及分化）miRNA与肿瘤（肿瘤-miRNA-靶点）miRNA与白血病（白血病-miRNA-靶点）miRNA与生物的遗传发育（miRNA-靶点-遗传发育）锐博生物miRNA研究策略miRNA研究解决方案miRNA表达检测miRNA筛选分析miRNA靶点分析miRNA细胞功能miRNA动物验证细胞或组织通过qRT-PCR、miRNA芯片、深度测序等进行miRNA表达谱分析3’UTR报告基因筛选高内涵细胞功能筛选报告基因的筛选信号通路筛选3’UTR报告基因验证靶基因siRNA验证qPCRmRNA验证WB蛋白验证过表达或者抑制miRNA的表达验证其对细胞表型的影响体内过表达或者抑制miRNA表达验证其对模型动物的影响Bulge-LoopTMmiRNAqRT-PCR引物Bulge-LoopTMmiRNAqRT-PCR标准品Bulge-LoopTMmiRNAqRT-PCR检测服务Bulge-LoopTMmiRNA表达谱检测服务miR-Ribo™mimics文库miR-Ribo™inhibitor文库3’UTR报告基因反向miRNA筛选服务细胞增殖、凋亡、周期等表型筛选服务信号通路筛选服务pmiR-RB-ReportTM3’UTR报告基因载体3’UTR报告基因验证服务siR-RiboTMsiRNAmiR-Ribo™mimicsmiR-Ribo™inhibitormiR-Ribo™表达载体miR-Ribo™spongeCell-LightTMEdU细胞增殖等检测试剂盒miR-Ribo™agomirmiR-Ribo™antagomrmiR-Ribo™表达载体miR-Ribo™sponge研究方案产品与服务锐博生物miRNA相关产品与服务产品miRNAqRT-PCR引物miRNAqRT-PCR标准品miRNAmimicsmiRNAprecusormiRNAAgomirmiRNAexpressionvectormiRNAinhibitormiRNAAntagomirmiRNAspongemiRNALibrarymiRNA靶基因预测miRNA靶基因表达载体文库服务miRNAqPCR定量检测甲基化检测载体构建（3‘UTR、miRNAvector、shRNAvector、sponge、基因载体）UTR报告载体筛选miRNA文库miRNA功能的高内涵筛选Bulge-loopRT-PCRLoopBulgemiRNAStep1:miRNARTForwardPrimerReversePrimerStep2:Real-timePCRSybrGreenBulge-LoopRTPrimer一套引物：RT-primerForwardprimerUniversalreverseprimer阳性对照：miRNAstanded服务：miRNA定量检测miRNA表达谱分析总RNA或miRNA抽Bulge-LoopqRT-PCR特异性PrimerRNA7a7b7c7d7e7f7g7ilet-7a1.000.000.880.650.090.010.000.10let-7b0.051.000.330.020.010.000.000.16let-7c0.190.441.000.100.070.000.000.64let-7d0.010.000.011.000.000.000.000.18let-7e0.010.000.010.001.000.000.000.29let-7f0.010.000.010.010.001.000.000.02let-7g0.000.000.000.000.000.001.000.15let-7i0.000.000.010.000.000.000.001.00Bulge-LoopqRT-PCR的灵敏度1234567891011120510152025303540Ctvaluelgcopys7ay=30.6351-2.5158xR2=0.9902Hsa-let-7a标准品：制作标准曲线绝对定量Bulge-LoopqRT-PCR技术优点特异性好灵敏度高无需探针经济实惠miRNA表达检测、miRNAqPCR芯片样本RNA抽提——RNA质量检测——反转录——定量PCR——数据分析miRNAprimer文库覆盖范围：miRBase15.0并随时更新物种：人、小鼠、大鼠（同源性高）样本：细胞、组织、血样应用范围：miRNA表达检测细胞、病例组织等表达谱芯片数据验证Bulge-loopqRT-PCR技术应用专利受理证书与GIBH裴端卿院长合作发表的文章客户发表的文章miRNA功能研究(细胞)Pri-miRNAPre-miRNAmiRNAmiRNAinhibitormiRNAantagomirmiRNAspongemiRNAmimicsmiRNAprecursormiRNAagomirmiRNAexpressingvectorsiRNA/miRNA功能研究（动物）miRNAinhibitor/antagomir/mimics/agomir等修饰方法BaseOOHOPOOOS-BaseOOCH3OPOOOO-BaseOFOPOOOO-BaseOOHOPOOOO-Cy3BaseOOHOPOOOO-BiotinBaseOOHOPOOOO-CholesterolBaseOOHOPOOOO-NH2Cy3标记S代甲基化氟代胆固醇生物素NH2连接antagomir-122,5‘-ascsaaacaccauugucacacuscscsas-Chol-3’甲基化、硫代、胆固醇修饰第一个miRNAantagomir模式图miRNAsponge文献报道的载体及结合位点模式图：•miRNA的结合位点在GFP蛋白的3’UTR区，通过II型RNA聚合酶转录；•miRNA的结合位点可以是与miRNA完全互补；•miRNA的结合位点也可以是种子区完全互补，其他不完全互补；•构建的以CMV为启动子的miRNA海绵锐博生物miRNAsponge载体miRNA抑制方法的选择比较项目miRNAinhibitormiRNAantagomirmiRNAsponge序列长度23nt23nt150bp左右化学合成序列性质单链RNA单链RNA双链DNA制备所需时间4天-2周1-2周1月以上化学修饰标记可以可以，且修饰方法更多不可以转染效率高高中等细胞毒性小小中等稳定性中等高高能否用于长效抑制不可可以未知能否用于动物实验不好可以未知是否影响基因组稳定性不会不会可能实验结果的可靠性可靠可靠可能受其它因素影响剂量控制容易容易不能实验可重复性好好