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1实验一玻璃仪器的清洗与包扎、干热灭菌一、玻璃器皿的清洗和灭菌(一)、新购的玻璃器皿1、先用热肥皂水刷洗，流水冲净。2、再浸泡于１～２％的盐酸中数小时，最后用流水冲净。2二、玻璃仪器的干热灭菌(1)将培养皿、吸管等玻璃器皿洗净干燥后，用报纸包好，或装入特制的铁筒中。(2)将包装好的玻璃仪器摆入电热烘箱中，彼此间留有一定的空隙以便流通空气。(3)关紧箱门，打开排气孔接上电源。(4)待箱内空气排出到一定程度时，关闭上排气孔，继续加热至一定温度后，调节温度控制旋钮固定温度，在160℃～165℃保持2小时即可。(5)待自然降温冷却后(60℃以下)才能开门取出玻璃器皿。3三、注意事项干热灭菌时电烘箱中物品不要摆得太拥挤，以免阻碍空气流通而影响灭菌效果；灭菌物品不要与电烘箱内壁的铁板接触。以免包装纸烤焦起火。4实验二培养基的配制、分装和灭菌一.实验目的明确培养基的配制原则；掌握配制培养基的一般方法和步骤；了解高压蒸汽灭菌的基本原理及应用范围；掌握高压蒸汽灭菌技术，了解几种常用灭菌方法。熟悉分离、培养微生物前的有关准备工作及操作方法。5二.实验材料其它：天平、牛角匙、电炉、1NNaOH、pH试纸、刻度搪瓷杯、量筒、漏斗、漏斗架、玻棒、带玻璃珠的三角瓶、带棉塞的无菌试管、无棉塞的空试管、培养皿、吸管、各种包装纸、防水纸、绳索、棉花、标签等6（一）培养基的制备（1）培养基是人工按一定比例配制的供微生物生长繁殖和合成代谢产物所需要的营养物质的混合物。培养基的原材料可分为碳源、氮源、无机盐、生长因素和水。根据微生物的种类和实验目的不同，培养基也有不同的种类和配制方法。（2）制备流程：称量→溶解→蒸煮→调pH→分装→包扎→灭菌三.实验原理7(3)操作步骤：1）称药品按实际用量计算后，按配方称取各种药品放入大烧杯中。牛肉膏可放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶解后倒入大烧杯；也可放在称量纸上称量，随后放人热水中，牛肉膏便与称量纸分离，立即取出纸片。蛋白胨极易吸潮，故称量时要迅速。2）加热溶解在烧杯中加入少于所需要的水量，小火加热，并用玻棒搅拌，待药品完全溶解后再补充水分至所需量。若配制固体培养基，则将称好的琼脂放入已溶解的药品中，再加热融化，此过程中需不断搅拌，以防琼脂糊底或溢出，最后补足所失的水分。83）调pH检测培养基的pH，若pH偏酸，可滴加1滴1mol•L-1NaOH，边加边搅拌，并随时用pH试纸检测，直至达到所需pH范围。若偏碱，则用1mol•L-1HCl进行调节。pH的调节通常放在加琼脂之前。应注意pH值不要调过头，以免回调而影响培养基内各离子的浓度。4）过滤液体培养基可用滤纸过滤，固体培养基可用4层纱布趁热过滤，以利结果的观察。但是供一般使用的培养基，该步可省略。9固体分装5）分装披实验要求，可将配制的培养基分装入试管或三角瓶内。分装时可用漏斗以免使培养基沾在管口或瓶口上面造成污染。分装量：固体培养基约为试管高度的1／5，灭菌后制成斜面。分装入三角瓶内以不超过其容积的一半为宜。半固体培养基以试管高度的1/3为宜。灭菌后垂直待凝。半固体液体分装试管三角烧瓶试管三角烧瓶1/31/41/21/51/2106）加棉塞试管口和三角瓶口塞上用普通棉花(非脱脂棉)制作的棉塞。棉塞的形状、大小和松紧度要合适，四周紧贴管壁，不留缝隙，才能起到防止杂菌侵入和有利通气的作用。要使棉塞总长约3／5塞入试管口或瓶口内，以防棉塞脱落。有些微生物需要更好的通气，则可用8层纱布制成通气塞。有时也可用试管帽或塑料塞代替棉塞。7）包扎加塞后，将三角瓶的棉塞外包一层牛皮纸，以防灭菌时冷凝水沾湿棉塞。8）培养基的灭菌时间和温度，需按照各种培养基的规定进行，以保证灭菌效果和不损培养基的必要成份。培养基经灭菌后，必须放37℃温室培养24h，无菌生长者方可使用。11培养基分装斜面制作包扎成捆挂标签12（4）关键步骤及注意事项①要严格按配方配制。②调pH不要过头。③干热灭菌要注意物品不要堆放过紧，注意温度的时间控制，70ºC以下放物、取物。④高压灭菌要注意物品不要过多，加热后排除冷空气，到时降压回零取物。13（二）灭菌灭菌：用物理或化学的方法杀灭物体上一切微生物。（1）干热灭菌法：把待灭菌的物品均匀地放入烘箱中，升温至160ºC，恒温1小时即可。此法适用于玻璃皿、金属用具等的灭菌。（2）高压蒸汽灭菌法（一般121ºC，30min，适用培养基）：把待灭菌的物品放在一个可密闭的加压蒸汽灭菌锅中进行的，以大量蒸汽使其中压力升高。由于蒸汽压的上升，水的沸点也随之提高。在蒸汽压达到1.055公斤/厘米2时，加压蒸汽灭菌锅内的温度可达到121ºC。在这种情况下，微生物（包括芽孢）在15～20分钟便会被杀死，而达到灭菌目的。如灭菌的对象是砂土、石蜡油等面积大、含菌多、传热差的物品，则应适当延长灭菌时间。14高压蒸汽灭菌法1．加水将内层灭菌桶取出，再向外层锅内加入适量的水，以水面与三角架相平为至。2．装料将装料桶放回锅内，装入待灭菌的物品。装有培养基的容器放置时要防止液体溢出，瓶塞不要紧贴桶壁，以防冷凝水沾湿棉塞。3．加盖将盖上与排气孔相连接的排气软管插人内层灭菌桶的排气槽内，摆正锅盖，对齐螺口，然后以同时旋紧相对的两个螺栓的方式拧紧所有螺栓，并打开排气阀；4．排气加热。待水煮沸后，水蒸汽和空气一起从排气孔排出。一般认为，当水沸后约5min，表明锅内空气已排净。5．升压当锅内空气排净时，即可关闭排气阀，压力开始上升。156．保压当压力表指针达到所需压力刻度时，控制热源。开始计时并维持压力至所需时间。本实验用121℃，20min灭菌。7．降压达到所需灭菌时间后，关闭热源，让压力自然下降到零后，打开排气阀。放净余下的蒸汽后，再打开锅盖，取出灭菌物品，倒掉锅内剩水。8．无菌检查将已灭菌培养基于37℃培养24h，无杂菌生长，即可待用。注意事项：使用灭菌锅应严格按照操作程序进行，避免发生事故；灭菌时，操作者切勿擅自离开，务必待压力下降到零后，才可打开锅盖。16（3）间歇灭菌法：待灭菌的物品放在灭菌器或蒸笼里，每天蒸煮1次，每次煮沸1h，连续3d重复进行。在每两次蒸煮之间，将物品（指培养基）放在37ºC恒温条件下培养过夜，这样可以使每次蒸煮后未杀死残留的芽孢萌发成营养体，以便下次蒸煮时杀灭。（4）巴氏灭菌法：有些食物会因高温破坏营养成分或影响质量，如牛奶、酱油、啤酒等，所以只能用较低的温度来杀死其中的病原微生物，这样既保持食物的营养和风味，又进行了消毒，保证了食品卫生。该法一般在62℃，30分钟既可达到消毒目的。此法为法国微生物学家巴斯德首创，故名为巴氏消毒法。17（三）棉塞的制作1819微生物接种技术是进行微生物实验和相关研究的基本操作技能。无菌操作是微生物接种技术的关键。斜面接种、液体接种、固体接种和穿刺接种操作均以获得生长良好的纯种微生物为目的。由于接种方法不同，采用的接种工具也有区别，如固体斜面培养体转接时用接种环；穿刺接种时用接种针，液体转接用移液管等。实验三微生物的接种技术20一、实验目的：了解各种微生物接种方法。二、实验材料和用具：已灭菌培养基、接种环、接种针、酒精灯、移液管、记号笔21三、实验步骤：1、斜面接种技术斜面接种是从已生长好的菌种斜面上挑取少量菌种移植至另一新鲜斜面培养基上的一种接种方法。具体操作如下：(1)贴标签接种前在试管上贴上标签，注明菌名、接种日期、接种人姓名等。贴在距试管口约2～3cm的位置。(若用记号笔标记则不需标签)。(2)点燃酒精灯。22(3)接种用接种环将少许菌种移接到贴好标签的试管斜面上。操作必须按无菌操作法进行。1)手持试管将菌种和待接斜面的两支试管用大姆指和其他四指握在左手中。使中指位于两试管之间部位。斜面面向操作者，并使它们位于水平位置。2)旋松管塞先用有于松动棉塞或塑料管盖，以便接种时拔出。3)取接种环右手拿接种环，在火焰上将环端灼烧灭菌．然后将有可能伸入试管中的其余部分均灼烧灭菌，重复此操作，再灼烧一次。234)拔管塞用右手的无名指、小指和手掌边先后取下菌种管和待接试管的管塞，然后让试管口缓缓过火灭菌(切勿烧得过烫)。试管拔塞后过火灭菌和取菌245)塞管塞取出接种环，灼烧试管口，并在火焰旁将管塞旋上。不要用试管去迎棉塞，以免试管在移动时纳入不洁空气。6)将接种环灼烧灭菌。放下接种环，再将棉花塞旋紧。252、液体接种技术(1)用斜面菌种接种液体培养基时，有下面两种情况：如接种量小，可用接种环取少量菌体移入培养基容器(试管或三角瓶等)中，将接种环在液体表面振荡或在器壁上轻轻摩擦把菌苔散开，抽出接种环，塞好棉塞，再将液体摇动，菌体即均匀分布在液体中。如接种量大，可先在斜面菌种管中注入定量无菌水．接种环把菌苔刮下研开，再把菌悬液倒入液体培养基中，倒前需将试管口在火焰上灭菌。(2)用液体培养物接种液体培养基时，可用无菌的吸管或移液管吸取菌液接种。263、固体接种技术固体接种最普遍的形式是接种固体菌制剂。因所用菌种或种子菌来源不同分为：1)用菌液接种固体料可用菌苔刮洗制成的悬液。接种时可按无菌操作法将菌液直接例入固体培养基中，搅拌均匀。注意接种所用菌液量要计算在固体料总加水量之内，否则往往在用液体种子菌接种后含水量加大，影响培养效果。2)用固体种子接种固体料包括用孢子粉、菌丝孢子混合种子菌或其他固体培养的种子菌，直接把接种材料混入灭菌的固体料。接种后必须充分搅拌．使之混合均匀。274、穿刺接种技术穿刺接种技术是一种用接种针从菌种斜面上挑取少量菌体并把它穿刺到固体或半固体的深层培养基中的接种方法。经穿刺接种后的菌种常作为保藏菌种的一种形式，同时也是检查细菌运动能力的一种方法，它只适宜于细菌和酵母的接种培养。28具体操作如下。(1)贴标签。(2)点燃酒精灯。(3)穿刺接种。(4)将接种过的试管直立于试管架上，放在37℃或28℃恒温箱中培养。24h后观察结果(注意：若具有运动能力的细菌，它能沿着接种线向外运动而弥散，故形成的穿刺线较粗而散、反之则细而密)。29(3)穿刺接种方法如下：1)手持试管。2)旋松棉塞。3)右手拿接种针在火焰上将针端灼烧灭菌，接着把在穿刺中可能伸入试管的其他部位也灼烧灭菌。4)用右手的小指和手掌边拔出棉塞。接种针先在培养基部分冷却。再用接种针的针尖沾取少量菌种。5)接种有两种手持操作法。一种是水平法，它类似于斜面接种法。一种则称垂直法。尽管穿刺时手持方法不同，但穿刺时所用接种针都必须挺直，将接种针自培养基中心垂直地刺入培养基中。穿刺时要做到手稳、动作轻巧快速，并且要将接种针穿刺到接近试管的底部，然后沿着接种线将针拔出。最后，塞上棉塞，再将接种针上残留的菌在火焰上烧掉。30斜面划线法（a）不同细菌直线接种长出的菌苔形态（b）31穿刺接种（a）水平穿刺接种；（b）垂直穿刺接种32四、实验报告列表比较各种接种方法及注意事项。五、问题和讨论1、斜面接种取菌前为什么要将灼烧过的接种针在无菌培养基上沾一下？2、穿刺接种时能否将接种针直接穿透培养基？33实验四显微镜的使用和维护（1）学习掌握显微镜的结构、功能和使用方法。（2）学习并掌握显微镜的维护的基本知识。一.实验目的34二、显微镜的构造1.光学部分:接目镜、接物镜、照明装置(聚光镜、虹彩光圈、反光镜等)。它使检视物放大,造成物象。2.机械部分:镜座、镜臂、镜筒、物镜转换器、载物台、载物台转移器、粗调节器、细调节器等部件。它起着支持调节固定等作用。35油镜使用的原理36镜头的识别低倍、高倍和油镜接物镜的识别方法，可直接读它上面刻的倍数，简便方法是低倍镜较短，高倍镜较长，油镜更长且上面刻有黑圈。使用时一定要识别清楚，不可认错，否则在转换物镜时会碰压镜头，损坏物镜的危险。放大倍数越高的接物镜它的焦距越小，工作距离也越小，因此油镜观察时镜头和玻片极为接近，使用时应该注意。3738显微镜的使用1.用前检查：零件是否齐全，镜头是否清洁。2.调节光亮度3.低倍镜观察：粗调、细调。4.依次再进行中倍、高倍观察5.油镜观察：高倍镜下找到清晰的物象后，提升聚光镜，在标本中央滴一滴香柏油，使油镜镜