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米曲霉培养及蛋白酶的分析•实验目的及要求：通过固态三角瓶培养米曲霉，掌握固态培养微生物原理和技术，并掌握蛋白酶活性的分析方法。•实验原理：固态培养方法（solidstatecultivation）：主要有散曲法和块曲法。部分黄酒用曲，红酒及酱油米曲霉培养属散曲法，而黄酒用曲及白酒用曲一般采用块曲法。固态制曲设备：实验室主要采用三角瓶或茄子瓶培养；种子扩大培养可将蒸热的物料置于竹匾中，接种后在温度和湿度都有控制的培养室进行培养；工业上目前主要是厚层通风池制曲；转式圆盘式固态培养装置正在试验推广之中。固态培养微生物，主要用于霉菌的培养，但细菌和酵母也可采用此法。其主要优点是节能，无废水污染。单位体积的生产效率教高。米曲霉（Aspergillusoryzae）属于曲霉菌（Aspergillus）。菌落初为白色，黄色，既而变为黄褐色至淡绿褐色，反面无色。•实验过程：•米曲霉菌种的纯化，制成斜面，将斜面菌种接入250ml三角瓶培养成种曲，再将种曲扩大培养（500ml）三角瓶。培养物经过水溶液萃取，制得粗酶制剂，取粗酶制剂进行蛋白酶活性测定。•米曲霉培养：本实验分为斜面培养和三角瓶培养两个阶段。三角瓶培养物在工厂中作为一级种子。试管斜面培养基：豆饼浸出汁：100克豆饼，加水500ml，浸泡4小时，煮沸3-4小时，纱布自然过滤，取液，调整至5波美度。没100ml豆汁加入可溶性淀粉2克，磷酸二氢钾0.1克，硫酸镁0.05克，硫酸铵0.05克，琼脂2克，自然pH。或采用马铃薯培养基：马铃薯200克，葡萄糖20克，琼脂15-20克，加水至1000ml，自然pH。三角瓶培养基制备：米曲霉的培养基：1：麸皮40克，面粉（或小麦）10克，水40ml。2：豆粕粉40克，麸皮36克，水44ml。装料厚度：1cm左右；灭菌：120℃，30min；接种及米曲霉的培养条件：米曲霉固态培养主要控制条件：温度，湿度，装料量，基质水分含量。固态培养前，原料的蒸熟及灭菌是同时进行的，实验室一般是在高压灭菌锅中进行；但在工厂中则是原料的煮熟和灭菌与发酵分别在不同的设备中进行。这点与液态发酵是不同的。28-30℃，培养20小时后，菌丝应布满培养基，第一次摇瓶，使培养基松散；每隔8小时检查一次，并摇瓶。培养时间一般为72小时。3.实验仪器、设备很材料恒温培养箱或者固态培养室，负压式超净工作台，显微镜，水浴锅，分光光度计，试管，茄子瓶，平板和500ml三角瓶等。4.实验分析项目和方法米曲霉蛋白酶活力的测定方法（1）称取充分研细的成曲5g，加入100ml蒸馏水，40℃水浴不间断搅拌20分钟，使其充分溶解。然后用干纱布过滤。吸取滤液1ml，用适当的缓冲液（0.02mol/LpH7.5磷酸缓冲液）稀释一定的倍数（如10、20、或者30倍）。（2）绘制标准曲线A、取试管7支，编号，按照下表加入试剂。单位：ml试管号试剂0123456标准酪氨酸溶液（100μg/ml）00.10.20.30.40.50.6蒸馏水1.00.90.80.70.60.50.4碳酸钠溶液（0.4mol/L）5555555酚试剂1111111B、摇匀，置于40℃恒温水浴中显色20分钟。C、用分光光度计在波长为660nm处测定OD值。D、以光吸收值为纵坐标，以酪氨酸的浓度为横坐标，绘制标准曲线。（3）蛋白酶活性的测定A、取试管三支，编号，每管中加入酶样品稀释液1ml，40℃水浴锅中预热2分钟，再加入同样预热的1.0%酪蛋白1ml，精确保温10分钟，立即加入0.4mol/L的三氯乙酸2ml，以终止反应，继续保温20分钟，使残余蛋白质沉淀后过滤。B、同时另做一对照试管，取酶样品稀释液1ml，三氯乙酸2ml，摇匀，然后再加入1.0%酪蛋白1ml，保温十分钟，保温放置20分钟，过滤。C、然后另取三支试管，编号，每管内加入滤液1ml，再加入0.4mol/L的碳酸钠5ml，以中和剩余的三氯乙酸，已稀释的福林试剂1ml摇匀，40℃保温发色20分钟，用分光光度计测定OD值（波长660nm）。同时另取两管做B滤液对照和蒸馏水空白对照。（4）计算在40℃下，每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸，定义为一个酶活力单位。样品蛋白酶活力单位（湿基）=(A×4n)/(10×5)A：由样品测定OD值，查标准曲线得相当的酪氨酸微克数；4：4ml反应液取出1ml测定；n：稀释倍数；10：反应十分钟。•实验数据处理及图表绘制：（1）标准曲线数据：试管号0123456浓度（μg/ml）010/720/730/740/750/760/7OD值00.0650.1660.2690.3920.4500.606（2）样品数据：培养基OD值平均OD值面粉对照样品1样品2豆粕粉对照样品1（3）标准曲线：