5逆境胁迫水稻幼苗及其生理指标分析

《植物生物学实验》逆境胁迫水稻幼苗及其生理指标分析实验一：水稻幼苗对盐胁迫的反应实验二：用氮蓝四唑法测定植物超氧化物歧化酶活力一、实验目的了解植物如何对逆境胁迫产生反应。观察分析水稻幼苗盐胁迫后发生的形态生理指标变化，用于指导农业生产。实验一：水稻幼苗对盐胁迫的反应二、实验原理逆境或胁迫（Stress）：对植物产生伤害的环境。逆境胁迫生物因素非生物因素温度：低温(冷害、冻害)，高温热害水分：干旱，湿害、涝害盐害酸雨紫外线（UV）营养亏缺、重金属病害虫害杂草逆境胁迫对植物伤害的表现形态变化：生长停滞，叶片萎蔫、卷曲、变黄、枯死等。生理生化：叶绿素含量减少，光合速率下降，呼吸速率下降或升高，细胞膜系统破坏，酶活性紊乱等。植物对逆境胁迫的适应适应方式：避逆性（stressavoidance）：植物会在时空上躲避开不良环境，如沙漠植物只在雨季生长、阴生植物在树荫下生长等。耐逆性（stresstolerance）：植物能够忍受逆境的作用。适应的形态生理变化：形态变化：如干旱条件下叶小、根系发达；淹水时扩大根部通气组织；冬季低温来临前生长停止、进入休眠等。生理变化：1.生物膜结构改变，形成胁迫蛋白，如热激蛋白、抗冻蛋白等。2.保护酶系统受破坏由超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)等组成的保护酶系统会降低或消除活性氧的危害。正常情况下，细胞内自由基的产生和清除处于动态平衡状态，自由基水平很低，不会伤害细胞。遭受逆境胁迫时，细胞内自由基积累过多，SOD等保护酶系统被破坏，产生许多有害的过氧化产物如丙二醛等，会伤害细胞。自由基会破坏膜结构，损伤大分子生命物质，引起一系列生理生化紊乱，导致植物死亡。活性氧：阴离子自由基、羟基自由基(-OH)、过氧化氢(H2O2)、单线态氧(1O2)，具有很强的氧化能力、对许多生物功能分子有破坏作用、引起膜的过氧化作用。自由基：具有未配对价电子的原子或原子团。天然的非酶自由基清除剂有维生素E、谷胱甘肽、抗坏血酸、类胡萝卜素等。3.增加渗透调节物质，有利吸水：糖、有机酸、一些无机离子如K+，其中脯氨酸是最有效的。4.增加脱落酸(ABA)含量。植物盐胁迫盐胁迫（盐害）：土壤盐分过多对植物造成危害。通常土壤含盐量达0.2-0.5%时就不利于植物生长，主要盐分：氯化钠、硫酸钠、碳酸钠、碳酸氢钠等。盐土：氯化钠和硫酸钠较多的土壤。碱土：碳酸钠和碳酸氢钠较多的土壤。盐碱土：含盐量0.6-10%。若盐胁迫强度较小，除盐后，植物生长可以恢复；若盐胁迫强度较大，除盐后，植物生长不可恢复盐害植物对盐胁迫的适应根据植物抗盐能力大小分为：盐生植物：耐盐范围1.5-2.0%，如碱蓬、芦苇、红树植物等。甜土植物（非盐生植物）：耐盐范围0.2-0.8%，如甜菜、高粱等大多数农作物。盐生植物的避盐机制避盐：植物通过某种方式将细胞内盐分控制在伤害阈值之下，以避免盐分过多对细胞伤害。泌盐：植物通过茎、叶上专门分泌盐分的盐腺(或盐囊泡)将盐分分泌到体外，减少或避免盐分对植物的伤害，如红树植物。稀盐：植物通过吸收大量水分和加速生长，稀释细胞内盐分浓度，并将盐分积累在茎叶的肉质化组织，维持体内盐分浓度的恒定，如碱蓬。拒盐：植物对盐有一定的选择性吸收，并能将盐分重新分配在植物的安全部位，从而降低盐分对地上部的伤害，如芦苇、灯芯草。泌盐的红树植物（盐腺）稀盐的碱蓬（肉质化）拒盐的盐生植物芦苇——地上部分拒盐灯芯草——地上部分拒盐植物盐胁迫的伤害表现生理干旱：土壤中盐分过多使土壤溶液水势下降，导致植物吸水困难，甚至体内水分有外渗的危险，造成生理干旱。离子失调：植物由于过多吸收某种盐类而排斥对另一些矿质盐的吸收，导致营养缺乏或产生毒害作用。代谢破坏：叶绿体解体、光合速率下降；蛋白质合成受抑制、分解加强，产生有毒物质，对细胞产生毒害。膜透性改变：高浓度NaCl可置换细胞膜结合Ca2+、K+，膜结构破坏、功能改变，细胞内K+、有机质等外渗。三、实验试剂与材料试剂：氯化钠主要仪器与器皿：电子天平，低温冰箱，烧杯，容量瓶，量筒，PE手套等。材料：水稻幼苗胁迫方式：盐胁迫，配制浓度0~0.3mol/L。四、实验步骤1.自己设计配制2个不同盐浓度的NaCl溶液并设置对照(CK)。2.挑选生长整齐一致的水稻秧苗60-90株，然后随机取10-15株于1个烧杯中，观测记载描述盐胁迫处理前各杯水稻秧苗的农艺形态性状(如苗高、叶片颜色、叶片数等)。3.各杯分别加入不同浓度NaCl溶液50ml左右（原则：根系要浸入溶液中），然后放置在实验架上进行盐胁迫处理。4.处理12-24h后(具体应视情况而定)，当高盐度处理的秧苗叶片开始出现卷曲时，观测记载处理后各杯秧苗农艺形态性状的变化，然后将各杯的秧苗叶片分别剪下、随机称取少量叶片0.2-0.5g，放入PE手套中并做好标记，置于冰箱冷冻保存备用。五、实验分组四个人组成一个小组进行水稻幼苗盐胁迫反应实验。每小组设置3个处理：1个对照和2个不同盐浓度，每处理2个重复，共6份样品。注意每杯要做好自己的标记、写上组别或姓名。预习下周实验：应用氮蓝四唑（NBT）法测定植物超氧化物歧化酶（SOD）的活力。《植物生物学实验》逆境胁迫水稻幼苗及其生理指标分析实验二：用氮蓝四唑（NBT）法测定植物超氧化物歧化酶（SOD）活力一、实验目的学习掌握用氮蓝四唑（NBT）法来测定植物超氧化物歧化酶（superoxidedismutase,SOD）的活力。了解不同盐浓度胁迫对水稻幼苗叶片SOD酶的影响。二、实验原理SOD发现：1938年Marn等人首次从牛红血球中分离得到SOD。SOD分布：广泛分布在各种生物体内，其活性高低可作为抗衰老的指标。SOD类型：SOD是含Cu、Zn、Mn、Fe金属元素、能清除超氧阴离子自由基的酶，其类型有Cu/Zn-SOD、Mn-SOD、Fe-SOD。SOD测定方法直接法：脉冲辐射分解法、电子顺磁共振波法、核磁共振法。间接法（化学法）：邻苯三酚自氧化法、细胞色素C还原法、羟胺法、黄嘌呤氧化酶-NBT法、肾上腺素法等。免疫法：放射免疫法、化学发光免疫分析法、ELISA法等。超氧阴离子自由基寿命短，不稳定，不易直接测定SOD活性，因而采用间接测定法。常用有3种：氮蓝四唑（NBT）光化还原法、邻苯三酚自氧化法、化学发光法。在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，还原的核黄素极易再氧化而产生氧自由基，可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，甲腙在560nm处有最大吸收。而SOD可清除氧自由基，从而抑制了甲腙的形成。光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。据此可以计算出酶活性大小。酶单位/样品量=NBT法测定SOD酶活性的原理核黄素：在有氧物质存在下，还原的核黄素与氧反应产生氧自由基。氮蓝四唑(NBT)：氧自由基将无色(或微黄)的NBT还原为蓝色甲腙。甲硫氨酸：电子供体——提供核黄素的还原反应所需的电子供体，使得核黄素的光激发还原反应得以进行。SOD酶：SOD通过催化氧自由基歧化反应，生成O2与H2O2，从而抑制蓝色甲腙形成。SOD催化反应如下：222222OOHHOOSOD（1）在一定盐度的胁迫下，植物叶片中SOD活性随盐浓度的升高而增强。（2）SOD酶能有效抑制膜脂过氧化作用，具有一定的保护作用。因此，盐胁迫的损伤在一定范围内是可以修复。膜系统的修复与SOD、CAT、POD等抗氧化酶的活性和抗坏血酸(ASA)、谷胱甘肽(GSH)等抗氧化物含量的变化密切相关。盐胁迫对植物叶片SOD酶的影响二、实验材料、仪器与试剂材料：水稻幼苗盐胁迫处理后的叶片。仪器设备：电子天平，高速台式离心机，分光光度计，移液器，荧光灯（反应试管处照度为4000Lx），试管数支，研钵，烧杯，离心管，量筒等。试剂：SOD抽提液：50mmol/L磷酸缓冲液（pH7.8）14.5mmol/L甲硫氨酸（Met）溶液：现配现用。2.25mmol/L氮蓝四唑溶液（NBT）：避光保存，现配现用。60μmol/L核黄素溶液：避光保存，现配现用。3μmol/LEDTA－Na2溶液主要试剂配制（供参考）：（1）50mmol/L磷酸钠缓冲液（pH7.8）：A液：NaH2PO4·2H2O（分子量156.01）：3.12g溶于蒸馏水，定溶至100ml。B液：Na2HPO4·12H2O（分子量358.14）：7.17g溶于蒸馏水，定溶至100ml。取A液8.5ml与B液91.5ml混合，定容至400ml，pH7.8。（2）SOD提取液：50mmol/L磷酸缓冲液[含0.1mmol/LEDTA；0.3%(w/v)TritonX-100；2-4%（w/v）聚乙烯聚吡咯烷酮（PVP）,pH7.8]。即每升磷酸缓冲液中加20gPVP，200μl0.5mol/L的EDTA母液，3mlTritonX-100。（3）14.5mmol/L甲硫氨酸（分子量149.21）：称2.163g溶于蒸馏水，定溶至1000ml(较难溶，需稍微加热）。（4）2.25mmol/LNBT（分子量817.7）：称92mg溶于50ml50mM磷酸磷酸缓冲液（pH7.8），现配现用，避光保存。（5）60μmol/L核黄素（分子量376.36）：称2.25mg溶于50ml50mM磷酸磷酸缓冲液（pH7.8），现配现用，避光保存。（6）3μmol/LEDTA-Na2（分子量372.24）：A、0.5mol/L：称9.306g溶于蒸馏水，定容至50ml。（注意：搅拌时用NaOH调pH至8.0才能完全溶解）。B、0.5mmol/L：取A液1ml用蒸馏水稀释定容至1000ml。C、3μmol/L：取B液3ml用磷酸缓冲液稀释定容至500ml。三、实验步骤1.酶液提取：将经盐胁迫处理、称好保存的水稻叶片0.2-0.5g置于预冷的研钵中，加1-2ml预冷的SOD提取液在冰浴上研磨成浆，并转移到离心管中，再用提取液清洗研钵，每次1ml，转移到同一离心管中，终体积不超过4ml；于6000-8000rpm下离心5-10min，上清液即为SOD酶粗提液，置于冰箱保存备用。2.反应体系试剂用量（ml/管）50mMSOD提取液1.514.5mM甲硫氨酸0.32.25mMNBT0.33μMEDTA-Na20.360μM核黄素0.3蒸馏水0.25酶液0.05（2支对照管以提取液代替酶液）总体积3.03.做预实验：在正式测定SOD活性之前，要进行酶液加入量的预实验，以确定最佳酶液浓度。酶液稀释：取其中一管酶液按1倍、10倍、100倍稀释。混合液配制：计算4-5支试管的用量，按反应体系表中各溶液(除酶液外)配制1份混合液(现用现配)。加酶液：在每支试管中加混合液2.95ml，再分别加入相对应的酶液量，其中2支空白对照用提取液代替酶液，混匀，马上用黑色塑料袋罩住。照光反应：取1支对照管于暗处，其余的置于试管架上，于4000Lx日光灯下反应20min（要求各管受光情况一致，光照时间视具体情况而定，如光照强、温度高则时间缩短，反之则延长，时间要严格控制）。终止反应：照光完毕马上用黑色塑料袋罩住试管架，以终止反应。SOD活性测定：以不照光的对照管做空白，分别测定各管OD值。确定酶液加入量：以抑制率在35%-65%为佳。4.正式实验准备8支相同型号的试管：6支样品、2支对照。混合液配制：按8-10支试管的用量配制（同预实验）。加酶液：各管加入混合液2.95ml，6支分别加入相对应的酶液量，2支对照管用提取液代替，混匀，遮光。照光反应：取1支对照管置暗处，其余各管于4000Lx日光灯下反应，时间根据预实验进行调整（缩短或延长）。终止反应：照光完成后，迅速用黑色垃圾袋罩住试管架，终止反应。SOD活性测定：以不照光的对照管做空白调零，逐一迅速测定各管在560nm处的OD值。四、结果计算一个SOD酶活性单位的确定：按最初测定SOD活性时的设计，以能抑制反应50%的酶量为一个SOD酶活性单位。如NBT在光照下被还