硝酸还原酶活性测定

实验七、硝酸还原酶活性测定实验目的：掌握测定硝酸还原酶活性的原理和方法;巩固分光光度计的使用方法。硝酸还原酶(NR)，是硝酸盐同化中第一个酶，也是限速酶，催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐，在植物的氮素代谢中发挥重要作用，与作物有效吸收和利用氮素肥料有关，对农作物产量和品质有重要影响，硝酸还原酶活性被当作植物营养或农田施肥的指标之一，也可作为品种选育的指标之一。高等植物硝酸还原酶的模型NR-含钼的黄素蛋白辅基是黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）高等植物硝酸还原酶的模型研究趋势【英文篇名】DeterminationMethodofNitrateReductaseActivityintheLeavesofCamptothecaacuminata【作者中文名】孙世芹;阎秀峰;【作者单位】东北林业大学;东北林业大学哈尔滨;150040;【文献出处】东北林业大学学报,JournalofNortheastForestryUniversity,编辑部邮箱2004年03期期刊荣誉：中文核心期刊要目总览ASPT来源刊中国期刊方阵CJFD收录刊【关键词】喜树;硝酸还原酶;体内法;【英文关键词】Camptothecaacuminata;Nitratereductase;Invivomethod;【摘要】以喜树(Camptothecaacuminata)为材料,探讨了用体内法测定其叶片硝酸还原酶活性的若干问题,比较分析了硝酸盐诱导、2,4-二硝基苯酚、三氯乙酸及煮沸等因素对硝酸还原酶活性测定结果的影响,以寻求体内法测定喜树叶片硝酸还原酶活性的最佳条件。试验表明,体内法是一种操作简便、准确可靠的测定喜树叶片硝酸还原酶活性的方法,为进一步研究喜树的氮代谢奠定了基础。维普检索的中文文献查询结果：共找到493条,耗时0.001407秒,当前页3/25标记数80条1.卫秀英侯小坤张百俊刘荷芬.氮肥对圆叶菠菜硝酸盐含量及其酶活性的影响[J].河南科技学院学报：自然科学版，2007，35(3)：35-37.2.刘永梅刘永定李敦海沈银武.氮磷对水华束丝藻生长及生理特性的影响[J].水生生物学报，2007，31(6)：774-779.3.张建平陈娟胡一鸿莫亿伟.镉胁迫对浮萍叶片光合功能的影响[J].农业环境科学学报，2007，26(6)：2027-2032.4.乔海涛杨洪强范伟国.缺素环境中平邑甜茶根系硝酸还原酶活性及硝态氮含量的变化[J].中国农学通报，2007，23(10)：114-117.5.田园梁亮宋波苏小俊袁希汉徐海陈劲枫.小白菜硝酸盐累积的基因型差异[J].江苏农业学报，2007，23(5)：459-463.6.徐永杰金慧波.北方温室无公害蔬菜施肥技术[J].现代化农业，2007(11)：12-12.7.无.壳聚糖对茶树氮代谢影响[J].中国茶叶，2007，29(5)：43-43.8.洪华生王玉珏王大志.海洋浮游植物硝酸还原酶研究进展[J].海洋科学，2007，31(10)：4-10.9.刘萍郭文善浦汉春封超年朱新开彭永欣.花后短暂高温对小麦籽粒蛋白质含量的影响及其生理机制[J].作物学报，2007，33(9)：1516-1522.10.何玲罗佳郭宁杨公明.浆水芹菜发酵过程中硝酸还原酶活性和亚硝酸盐含量的变化[J].西北农林科技大学学报，2007，35(9)：184-188,194.11.董庆霖赵学明邢向英.强光照对雨生红球藻合成虾青素的影响[J].高校化学工程学报，2007，21(4)：685-688.12.刘亚丽姬生栋薛华政张献伟李鹏祝红燕陈鹏盛有明.转大豆DNA高蛋白小麦变异株系的硝酸还原酶、叶绿素含量分析[J].河南农业科学，2007(7)：25-27.13.马林孟凡德石书兵宋维彦聂文魁刘心雨郭飞.不同耕作方式对小麦硝酸还原酶活性和旗叶衰老指标的影响[J].新疆农业大学学报，2007，30(3)：23-27.14.卫晓轶李国清王艳朋李浩川靳静晨田国伟刘宗华.不同基因型玉米某些氮代谢生理指标的差异研究[J].河南农业大学学报，2007，41(3)：264-268.15.曹翠玲刘建朝姚晨.不同呼吸抑制剂对小麦幼苗根系硝酸还原酶活性的影响[J].西北农林科技大学学报，2007，35(8)：185-188.16.张智猛万书波宁堂原戴良香.不同花生品种氮代谢相关酶活性的研究[J].植物营养与肥料学报，2007，13(4)：707-713.17.张绪成上官周平.施氮量对小麦叶片硝酸还原酶活性、一氧化氮含量和气体交换的影响[J].应用生态学报，2007，18(7)：1447-1452.18.毛伟华龚亚明夏晓剑周艳虹喻景权.黄瓜硝酸还原酶cDNA片段的克隆及其在缺氮胁迫下的表达[J].浙江农业学报，2007，19(3)：160-163.19.董庆霖邢向英赵学明.光照强度对雨生红球藻合成虾青素的影响[J].水生生物学报，2007，31(3)：445-447.实验原理在一定条件下，NO2的生成量与硝酸还原酶活性呈正相关。NO2可从组织渗透到外界溶液中，通过测定溶液中NO2含量的增加检测该酶活性。NO2含量可用磺胺显色法测定，即在酸性条件下，NO2与磺胺和α－萘胺反应，生成红色化合物，在520nm下比色测定。实验器材1.天平2.真空泵3.分光光度计4.恒温箱5.剪刀6.试管7.三角瓶8.移液管主要试剂0.1mol/LpH7.5磷酸缓冲液0.2mol/LKNO3磺胺试剂α-萘胺试剂亚硝酸钠标准液1.标准曲线绘制亚硝酸钠标准液磺胺试剂α-萘胺试剂体积1ml2ml2ml亚硝酸钠标准液浓度0、0.5、1.0、2.0、3.0ug/ml，即共5管溶液。混匀上述溶液，静置20min；520nm波长下测定吸光度，绘制标准曲线。实验步骤2.酶的诱导与还原反应1.将实验材料用水洗净，吸水纸吸干；2.配制对照液(5mlPBS+5mlH20)和诱导液(5mlPBS+5mlKNO3)，置于两个烧杯中；3.用剪刀将叶片剪成边长为0.4cm的正方形小块，天平上称取0.5g重的两等份，分别投入到上述两烧杯中；4.将盛有叶片的两个烧杯进行真空抽气30min，最好使叶片沉入烧杯底部，30℃恒温箱中保温30min。5.从两烧杯中分别吸取1ml反应液，注入两只试管中；6.再分别依次加入2ml磺胺试剂和2mlα-萘胺试剂，混匀后室温静置20min;7.520nm波长下测定吸光度。8.根据标准曲线测得NO2浓度，对照液、诱导液NO2浓度差即为NO2的生成量，可表示硝酸还原酶的活性。实验步骤