抗生素的作用机制

1第三章抗生素的作用机制2第一节一般性论述抗生素是微生物群体生长的抑制物。群体生长来自单个细胞繁殖，即构成细胞物质的复制和随后细胞分裂为两个子细胞过程。3抗生素影响微生物细胞的代谢的条件(1)进入细胞并到达作用位点；(2)物理性地结合于细胞结构(靶分子)，该细胞结构参与对保持细胞生长或内环境稳定必不可少的某一过程；(3)抗生素与主要酶或细胞结构结合。抑制细胞壁的合成影响胞浆膜的通透性抑制DNA合成抑制蛋白质合成抑制RNA合成影响叶酸代谢抗生素的作用机制抗生素在分子水平上干扰微生物细胞任一基本代谢的某一种机制。5根据抗生素干扰代谢过程的不同，抗生素通常分为五大类(1)细胞壁合成抑制物；(2)遗传物质的复制或转录抑制物；(3)蛋白质合成抑制物；(4)细胞膜功能抑制物；(5)抗代谢物。6第二节研究方法为了阐明一个抗生素的作用机制，需要进行一系列的实验研究。包括：(1)完整细胞水平，(2)部分纯化的无细胞体系水平，(3)一个或多个纯化的酶体系水平。7一、在完整细胞水平上对活性的研究用标记的胸苷追踪DNA合成、尿苷追踪RNA合成。苯丙氨酸追踪蛋白质合成。乙酰葡萄糖胺追踪肽聚糖合成。敏感菌株的培养基放射性标记特异前体物蛋白质DNA肽聚糖RNA抗生素8利福平在完整细胞水平上的作用机制原初效应9二、在部分纯化的无细胞体系中对活性的研究一旦确定了抗生素的原初效应，接着就必须阐明产生抑制是因为抗生素干扰：(1)前体物的合成或激活；(2)参与聚合的酶或细胞器；(3)决定前体物掺入聚合物的信息系统。10具体操作过程如果抗生素在体外抑制与在生长细胞中所抑制的大分子相同，那么它通常作用在聚合过程，也可能作用于信息分子；如果体外不抑制，而生长细胞中抑制，则可能作用于前体物的合成或激活。1.聚合的酶或细胞器前体物蛋白质DNA肽聚糖2.信息系统RNA合成或激活抗生素细胞外实验：部分纯化的细胞抽提物11利福平在部分纯化的无细胞体系中作用机制这个体外转录体系由细菌的RNA聚合酶催化时，其活性将被利福平抑制，由真核细胞的RNA聚合酶催化时，其活性并不被利福平抑制。推论：生长细胞中RNA合成的阻断，来自于利福平与RNA聚合酶的直接作用。RNA聚合酶核苷三磷酸RNADNA为模板利福平×12三、在纯化的酶体系中对活性的研究聚合酶通常包含多种成分，每一种成分都可能成为抗生素作用的靶子。在一定限度内，能够确定是哪一种酶反应受到了干扰，并且鉴定出哪一个成分是抗生素作用的靶子。13靶聚合体系的鉴定（1）通过放射化学方法或检测蛋白质色谱变化或蛋白质电泳迁移率变化，鉴定出抗生素与酶蛋白结合后形成的复合物。（2）从抗生素抗性突变株中可以分离出抗生素作用的靶蛋白发生了变化而产生的抗性菌株。在体外每次分别将原株中靶蛋白的一种成分用抗性变株来代替构成重组系统，根据抑制的消失可以确定靶蛋白中与抗生素活性有关的组份。14利福平在纯化的酶体系中的作用机制ββ亚基突变×RNAβ亚基＋利福平的复合物×利福平×15第三节细胞壁合成抑制物首先简要介绍不同种类微生物的细胞壁化学结构和主要成分的合成途径。16一、细胞壁的结构和构造细胞壁的功能保持细菌外形维持菌体内高渗透压17肽聚糖的结构N—乙酰葡萄糖胺(G)N—乙酰胞壁酸(M)181．G＋细菌的细胞壁G＋细菌的细胞壁是一层均一物质，由肽聚糖和相当数量的磷壁酸组成。壁磷壁酸膜磷壁酸192脂蛋白2．G－－细菌的细胞壁3肽聚糖1外膜亲水性的跨外膜孔蛋白壁膜间隙质膜20成分肽聚糖磷壁酸类脂质蛋白质占细胞壁干重的%含量很高（30-95）含量较高（50）一般无（2）0含量很低（5-20）0含量较高（10-20）含量较高G＋G－G＋`G－细胞壁成分的区别21链球菌G+菌----紫色22大肠杆菌G-菌----淡红色23铜绿假单胞菌G-菌----淡红色243．肽聚糖的生物合成大肠杆菌肽聚糖的生物合成可以分为三个阶段。(1)基本单元UDP-胞壁酰五肽的形成(2)单体的形成及跨膜转运(3)肽聚糖链的组装及三维结构的构建25UDP－胞壁酰五肽的结构UDP-N-乙酰葡萄糖胺GM26(1)基本单元UDP-胞壁酰五肽的形成N－乙酰葡萄糖胺（G）以其激活形式UDP－G与磷酸烯醇式丙酸酮缩合，双键还原形成UDP-N－乙酰胞壁酸（UDP－M）；L－Ala、D－Glu和间－DAP相继加到UDP－M上，生成中间物胞壁酰三肽，二肽D－Ala－D－Ala(由两个L－Ala分子异构和缩合而来)又加到胞壁酰二肽上，形成UDP－胞壁酰五肽终产物。所有这些反应均发生在细胞质中。27UDP－胞壁酰五肽形成示意图磷酸烯醇式丙酸酮UDP-N-乙酰葡萄糖胺UDP-N-乙酰胞壁酸胞壁酰三肽UDP－胞壁酰五肽胞浆28(2)单体的形成及跨膜转运UDP－胞壁酰五肽首先脱去UMP，胞壁酸的端基异构体C原子与十一聚异戊二烯磷酸(类脂分子，作为胞壁酰五肽的载体)形成二磷酸二酯键。通过β，1－4糖苷键，N－乙酰葡萄糖胺加到胞壁酸上，从而完成了单体的合成。这些反应发生在细胞质膜上。29单体在上合成的示意图UDP－胞壁酰五肽十一聚异戊二烯磷酸UDP－Glcβ，1－4糖苷键细胞膜30(3)肽聚糖链的组装及三维结构的构建肽聚糖合成的最后几步是由几种酶催化完成。①转糖基酶：催化M上的C－1与G上的C－4之间形成β－糖苷键。②转肽酶：催化4－位上的D－Ala与邻近五肽上DAP的ε－氮形成肽键(该反应通过释放五肽供体上的末端D－Ala而发生)。③D－羧肽酶：催化五肽末端D－Ala水解。④内肽酶：催化水解已合成的肽聚糖链上的肽链。微生物在生长及分裂期间，必然要合成新的肽聚糖，这时内肽酶在细胞壁内表面变得活跃起来，部分地水解已存在的链，产生出自由末端，通过转肽及转糖基反应，接受新生的肽聚糖链。31肽聚糖链合成的示意图五肽通过转肽反应及转糖基反应，双糖五肽被转到受体上，即新生肽聚糖链。在转糖基反应中，十一聚异戊二烯焦磷酸释放出来，重新进入循环。P-P-LipidHO-G-M-P-P-Lipid细胞壁五肽转糖基反应32大肠杆菌肽聚糖的结构转糖基酶,转糖基反应转肽酶,转肽反应D－羧肽酶内肽酶33细菌的肽聚糖合成所有细菌种类的肽聚糖合成，都是按照大肠杆菌模式进行的。但是，在金黄色葡萄球菌中，发生了重要变化：①五肽中第二位氨基酸是Lys，而不是m－DAP。②二糖五肽合成后，五个Gly分子通过肽键连接在Lys的ε－NH2上。③转肽反应在五肽次末端D－Ala的羧基(同时释放出末端D－Ala)和末端Gly的氨基之间发生。34大肠杆菌和金黄色葡萄球菌肽聚糖的结构35二、细菌细胞壁合成抑制物的特性杀菌作用：可以通过两种机制产生杀菌效应，裂解或不裂解细胞。在第一种情况下，肽聚糖结构变得松弛，导致细胞由于内部高渗透压而解聚死亡；在第二种情况下，可能有其他作用机制的介入，譬如不可逆地抑制横隔形成（PBP-3）或细胞变长(PBP-3)，从而导致细胞死亡。对静止细胞无作用。对缺乏细胞壁的微生物（支原体、L型细菌、原生质体）没有作用。36三、肽聚糖合成抑制物的例子根据作用部位，肽聚糖合成抑制物可分为：1.胞壁酰五肽合成抑制剂2.膜上反应抑制物3.链延伸及三维细胞壁结构形成抑制物371．胞壁酰五肽合成抑制剂这些抗生素都是肽聚糖合成前期反应的抑制物。38磷霉素的作用机制烯醇式丙酮酰－N－G丙酮酰转移酶不可逆，杀菌作用磷霉素×39环丝氨酸的作用机制丙氨酸消旋酶环丝氨酸D－丙氨烯－D－丙氨酸二肽合成酶××402．膜上反应抑制物一个是杆菌肽，使用在畜牧业上；另一个是雷莫拉宁。41杆菌肽的的作用机制十一聚异戊二烯磷酸十一聚异戊二烯焦磷酸UDP－胞壁酰五肽杆菌肽×42雷莫拉宁的作用机制十一聚异戊二烯磷酸十一聚异戊二烯焦磷酸UDP－胞壁酰五肽UDP－GlcN－乙酰葡萄糖胺转移酶十一聚异戊二烯－胞壁酰－五肽雷莫拉宁×它能够快速而特异地抑制生长细胞对N－乙酰葡萄糖胺的吸收，导致细胞内UDP－胞壁酰五肽的积累，而抑制细胞壁合成。43３.链延伸及三维细胞壁结构形成抑制物β－内酰胺类抗生素：这个家族抗生素包括青霉素、头孢菌素、头霉素和非经典的β－内酰胺类抗生素，如氨曲南和亚胺培南。这些抗生素的作用机制相似，即阻断肽聚糖合成的最后一个阶段以干扰细胞壁形成。44青霉素G对放射性同位素标记前体物掺入生长细菌中DNA、RNA、蛋白质及细胞壁的效应β—内酰胺类抗生素的作用机制1.抑制细菌细胞壁的合成2.触发细菌的自溶酶活性β—内酰胺类抗生素抑制细菌细胞壁粘肽转肽酶（青霉素结合蛋白PBPs）粘肽合成受阻细菌细胞壁缺损水分渗入胞浆菌体膨胀破裂而死亡。MGGMGGMGGMGG转肽酶青霉素头孢菌素D-丙氨酸-内酰胺类作用机制47青霉素和D－Ala－D－Ala二肽的结构构象NORNOOO胞壁酰五肽D-Ala-D-Ala末端构象NORNOOO青霉素构象48青霉素结合蛋白(PBP)被β－内酰胺类抗生素抑制的酶，因它们能够与相应的抗生素形成共价键而得到鉴别，它们称为青霉素结合蛋白(PBP)。细胞生长必需的PBPs一般具有转肽酶活力，它们控制着细胞延长（PBP-1）及分裂(PBP-3)这些基本过程。β－内酰胺类抗生素在抑制参与肽聚糖合成的酶上，还是有一定程度的不同：有的抑制转肽酶，有的抑制d－羧肽酶，有的间接抑制转糖基作用的酶。CH-COOHR-C-NH-CH-CH=OCSCH3CH3C—N青霉素CH-COOHR-C-NH-CH-CH2=OCH3C—NO=D-丙氨酰-D-丙氨酸青霉素结合蛋白（PBPs，转肽酶）胞壁酸50第四节核酸复制与转录抑制物DNA复制RNA转录51一、遗传信息的转录与复制核酸合成分两步：(1)从细胞代谢中间物分子合成前体物(核苷酸和脱氧核苷酸)(2)酶催化核苷酸聚合形成大分子，其顺序由模板DNA碱基顺序决定。若干种不同的酶参与了DNA复制。DNA复制52前导链滞后链DNA在复制时，其双链首先解开，形成复制叉，而复制叉的形成则是由多种蛋白质及酶参与的较复杂的复制过程。前导链与后随链的差别在于前者从复制起始点开始按5’—3’持续的合成下去，不形成冈崎片段，后者则随着复制叉的出现，不断合成长约2—3kb的冈崎片段。单链DNA结合蛋白DNA解旋酶大肠杆菌中的Dna蛋白53大肠杆菌DNA复制示意模型(1)DNA解旋酶解开双螺旋。一些蛋白保持双链分开。(2)在前导链上由引物酶催化合成一段RNA引物。(3)DNA聚合酶III利用RNA为引物，在3’－OH上合成冈崎片段。(4，5)DNA聚合酶I降解RNA片段并完成DNA合成。(6)连接酶将相邻片段连接上。RNA链54原核细胞中RNA合成RNA合成过程相对简单。在细菌中是由RNA聚合酶催化的。RNA聚合酶由四个蛋白质亚基α、α、β、β’及一个σ因子(对识别转录起始DNA顺序必需)组成。55RNA聚合酶的功能(1)通过与DNA形成复合体将DNA双链分开。(2)将第一个核苷酸放在其中一条DNA链上的正确位置上(起始)。(3)将第二个核苷酸掺入并在第一和第二个核苷酸之间形成第一个磷酸二酯键。(4)沿DNA链移动，并继续将核苷酸不断掺入，并以磷酸二酯键将它们连接起来(延伸)。(5)当到达一段特殊的DNA顺序时，合成过程终止(终止)。在许多情况下，终止需要另一个蛋白质因子rho(ρ)参与。56真核细胞中RNA聚合酶真核细胞中含有三种RNA聚合酶，并且每种都由几种蛋白质亚基组成。不同的聚合酶合成不同种类的RNA。位于核仁的RNA聚合酶I合成28S和18SrRNA；RNA聚合酶II合成各种mRNA；RNA聚合酶III合成tRNA和5SrRNA。57二、复制和转录抑制物范例复制和转录抑制物分为两类：前体类似物，抑制前体物的合成；DNA模板功能抑制物和酶(促旋酶、DNA聚合酶、RNA聚合酶)抑制物，抑制核酸聚合。58核酸合成抑制物的作用机制DNA聚合酶RNA聚合酶促旋酶59１．DNA模板功能抑制物它们干扰DNA的模板功能，从而抑制复制和转录。它们可与模板DNA形成无功能复合物(三级结构被破坏)，或者使模板DNA结构发生化学变化(链缺口、碱基的剪切、双链间形成共价键)。6