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卫生与微生物学基础知识《药品生产质量管理规范》附录中第二十及二十一条明确规定：洁净室区内的人员数量应严格控制；其工作人员（包括清洁工和设备维修工）都必须定期进行卫生和微生物学基础知识方面的培训。未经培训的外部人员在生产期间进入洁净区时，应对他们进行特别详细的指导和监督。微生物的发现★微生物学的开山祖—列文虎克1674年荷兰人列文虎克用自己制造的能放大200-300倍的显微镜观察了污水、牙垢、腐败有机物等，发现了许许多多肉眼看不见的微小的生物，为微生物的存在提供了有力的证据。★微生物方法学和医学微生物学的奠基人—科赫：德国科学家科赫发现了炭疽杆菌、结核杆菌、霍乱弧菌、鼠疫杆菌，并第一次用科学的方法证明某种特定的微生物是某种特定疾病的病原。于1905年，获得了诺贝尔医学和生理学奖，主要是为了表彰他在肺结核研究方面的贡献。★微生物学的奠基人—巴斯德：从1862年起法国科学家巴斯德解决了葡萄酒变酸问题、发明了巴斯德灭菌法、医治了蚕病、炭疽病和疯狗病而成为伟大的微生物奠基人。微生物的定义微生物(microorganism,microbe):是一些肉眼难以看到的微小生物的总称。按其结构、化学组成及分化程度可分为:★原核类:仅有原始核质，无核仁或核膜，细胞器很不完善。如细菌、放线菌、支原体、立克次氏体、衣原体、螺旋体★真核类:细胞核的分化程度较高，有核膜、核仁和染色体，细胞器完整。如真菌（酵母菌和霉菌）、原生动物、藻类★非细胞类:体积微小，能通过除菌过滤器。如病毒和朊病毒等微生物的五大特点★个体小,面积大：小于0.1mm，肉眼不可见。★分布广,种类多(10万多种)：自然界中到处都有，如水、空气、土壤等,土壤中的数量最多。★代谢强，转化快：发酵乳糖的细菌在1小时内可分解其自重1000～10000倍的乳糖★生长旺，繁殖快：微生物有惊人的繁殖速度，大多数微生物几十分钟内就可以繁殖一代★适应性强，易变异：耐药性产生的原因菌落单位★菌落单位----cfu(colony-formingunits)由单个菌细胞或几个同种菌细胞在培养基上长成肉眼可见的菌落，每个菌落就是1cfu。光滑型菌落粗糙型菌落实验室中微生物的生长基质★培养基：人们提供微生物生长繁殖和生物合成各种代谢产物所需要的按一定比例配制的多种营养物质的混合体。培养基中主要包含了微生物生长所需要的碳源、氮源、无机盐及微量元素。培养基按物理性状可分为：①固体培养基②半固体培养基③液体培养基微生物的生长规律微生物整个生长过程可以分为4个阶段：★延滞期：细胞变大，细胞内RNA含量增高，培养基不丰富时延滞期较长。★对数期：细胞分裂最快，代谢旺盛，生长速率由营养成分决定。★稳定期：总体数量保持不变，开始产生代谢产物或开始形成芽孢。★衰亡期：由于代谢毒素的积累，死亡数超过新生数。最易处理期微生物种类－八大类★细菌：肺炎球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌★真菌：蘑菇、霉菌、酵母菌、念珠菌（湿疹）★放线菌：从放线菌中发现链霉素、土霉素★支原体：肺炎支原体★衣原体：沙眼★立克次体：斑疹伤寒★螺旋体：梅毒★病毒：甲、乙肝病毒，麻疹病毒，流感病毒。★细菌：是一类细胞细而短、直径一般为0.5~5.0μm，结构简单、细胞壁坚韧，以二分裂方式无性繁殖的原核微生物，分布广泛。生长最适温度为30~35℃，主要去除方法有紫外杀菌法、滤膜过滤法及高温杀灭法等。个别细菌如：嗜热脂肪芽孢杆菌，能在121℃条件，可耐受4~5min。灭菌柜验证中作为生物指示剂最适合生长条件为55~60℃★真菌：是一类有细胞壁，无叶绿素，以寄生或腐生方式生存，少数为单细胞，多数为多细胞，能进行无性或有性繁殖的一类真核细胞型微生物。包括单细胞与多细胞两类，单细胞真菌呈圆形或卵圆形称为酵母菌；多细胞真菌由菌丝和孢子组成，称为丝状菌或霉菌。真菌生长的最适的温度为23～28℃，一般加热60~70℃1小时即被杀死，用一定浓度的酒精及甲醛也可杀死。★病毒：属非细胞型微生物，在自然界分布非常广泛，可在人、动物、植物、真菌和细菌中寄居并引起感染。病毒是体积最小、结构最简单的微生物，它仅有一种核酸（DNA或RNA）作其遗传物质。微生物的菌落形态微生物的显微形态★细菌的形态：球状、杆状、螺旋状。★酵母菌的形态：球状、卵圆状、椭圆状、柱状或香肠状等。★霉菌的形态：丝状。★病毒的形态：球状、卵圆形、砖形、杆状、蝌蚪状、丝状等。葡萄球菌酵母菌(芽痕)棒状杆菌大肠杆菌弧状菌链球菌★革兰氏染色法：一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤。1.涂片固定。2.草酸铵结晶紫染1分钟。3.自来水冲洗。4.加碘液覆盖涂面染1分钟。5.水洗，用吸水纸吸去水分。6.加95%酒精数滴，并轻轻摇动进行脱色，30秒后水洗，吸去水分。7.蕃红染色液（稀）（或沙黄）染10秒钟后，自来水冲洗。干燥，镜检。染色的结果：革兰氏正反应(G+)菌体都呈紫色；革兰氏负反应(G-)菌体都呈红色。意义：①鉴别细菌；②选择药物；③与致病性有关(G+→外毒素)(G-→内毒素)显微镜结构微生物的培养及检查★平板培养(固态)：将琼脂等凝胶状固体培养基制成平面状，然后在此平面上培养微生物或多细胞生物的细胞、组织或器官。开放式过滤器滤膜孔径0.45μm★试管培养(液态)：按指定的培养基配方配制后灌于试管中，将供试液进行过滤的滤膜培养在试管中的方法。封闭式过滤器热原与内毒素许多细菌、病毒和真菌（如酵母菌）都能产生热原。★热原：是微量即可引起恒温动物体温异常升高的物质的总称主要物质为细菌内毒素、胞壁酰二肽及其他抗原抗体复合物等。（家兔法进行检查）★细菌内毒素：一般指革兰阴性细菌细胞壁的结构成分，主要是脂多糖。（鲎试剂法进行检查）①耐热性：250℃加热30min，才可彻底破坏；②滤过性：其体积小，约在1~5nm之间；③具有水溶性及不挥发性，可被活性碳吸附；④能被强酸、强碱及氧化剂破坏。消毒与灭菌★消毒：杀死物体上病源微生物的方法,并不一定能杀死所有微生物细菌的芽孢。芽孢是细菌的休眠体，在适宜的条件下可以重新转变成为营养态细胞，对热力干燥、辐射、化学消毒等理化因素有强大的抵抗力。★灭菌：杀灭物体上所有微生物的方法。灭菌比消毒要求高，包括杀灭细菌芽孢在内的全部病原微生物和非病原微生物。分为物理与化学灭菌法，物理灭菌包括：①热力灭菌法(干热灭菌法与湿热灭菌法)②辐射灭菌法(波长200~300nm紫外线，距离照射物不超过1m)③过滤除菌法(除菌器孔径≤0.22μm)④超声杀菌法⑤干燥与低温抑菌法消毒与灭菌化学法用法及用量作用机制用途甲醛熏蒸40%甲醛：高锰酸钾=10ml：5g(每立方米)蛋白质变性高浓度可达灭菌。此方法有致癌作用，尽量不用于室内空气消毒环氧乙烷浓度必须低于3%非特异性烷基化常用医疗器械灭菌剂臭氧熏蒸10-15ppm湿度70-80%破坏核物质的复制空气杀菌过氧化氢3%医用，35%漂白蛋白质变性不耐热的塑料制品、外科伤口清洗过氧乙酸16~20%喷洒、擦拭蛋白质沉淀耐腐蚀物品、环境及皮肤等的消毒乙醇75%喷洒、擦拭蛋白质变性皮肤消毒碘伏浸泡、擦拭及冲洗卤化作用皮肤、粘膜的擦拭和清洗苯扎溴铵0.1%蛋白质变性地面、器具表面、皮肤消毒84消毒液1：24(水)氧化作用表面擦拭、白色衣物浸泡等GMP与微生物在药品生产过程中，由于受到各种因素的影响(人员、设备、物料、操作方法及环境)都可能导致药品受到微生物的污染，因此GMP对以上各种因素都提出了防止污染的基本要求。人员与微生物人员是洁净室中的最大污染源。人在代谢过程中会释放和分泌污染物，人体表面、衣服能沾染、携带污染物，在洁净室内的各种动作也会产生微粒和微生物。GMP对人员有着严格的要求。★防范措施：1.建立个人健康档案新员工入厂全面体检，直接接触药品的生产人员每年至少体检一次，如发现有传染疾病应立即隔离。2.清洁的个人卫生①勤洗澡、理发、剪指甲②正确的洗手、更衣流程及防护方式3.洁净区内的自我约束①不佩带首饰，不化妆②进出次数应可能地少，在操作过程中应减小动作幅度③规范各类操作及避免违规行为一次更鞋：阻断外界粘在鞋底的垃圾、颗粒及微生物。相对而言，脚底是最脏的部分。脱去外套：阻断外界沉降在外套上的颗粒和微生物。一更洗手：规范的洗手能消除手部皮肤的污垢和大部分的微生物。洗手一定要用洗手液和充足的流水。二更带口罩：阻断鼻腔、呼吸道的微生物发散，洁净区内不能脱下口罩。带发套：阻断头发、头皮表面的微生物发散。保证发套完整的包裹头发。穿连体服：阻断体表皮肤的微生物发散。洁净区内不能解开连体服。手消毒：再次消除手部的细菌和微生物。75%的酒精能杀灭手部95%以上的微生物。设备与微生物设备的卫生应从设备的设计开始，要求产尘少、脱落粒子少、易清洗、消毒和灭菌。设备与物料的接触面不得与物料反应，不得吸附物料，设备的内表面材质要平整、光滑，凹凸不平的区域不仅不易清洗，而且易存留残液等，它将成为微生物繁殖滋生的场所。管道的安装要避免批与批之间的交叉污染，管道要能定期清洗消毒。★防范措施：①建立相应的设备清洁保养制度及规程②保持一贯的清洁状态，发现污渍、污水、残余物等应立即清除③机修人员在线维修设备时，应注意操作尽量减少对药品产生污染④对直接接触药品的设备进行清洁验证物料与微生物对于物料卫生的问题，从供应商的审计、物料进厂后的检验、使用全过程，均要严格按照GMP规定的卫生要求进行。我公司物料主要包括：原辅料、玻瓶、胶塞及工艺用水。★防范措施：①正确的原辅料的脱包、消毒、运送(容器)及投加操作。②正确的胶塞清洗流程。③对精洗残余水、胶塞清洗水及工艺用水的定期监测。④原辅料使用前的抽检。操作方法与微生物洁净区人员的操作是否规范，影响药品灭菌前的微生物负荷，最终将影响产品的无菌保证值(SAL)。F0≥6×D121℃+D121℃×lgN0F0:标准灭菌时间;N0：产品灭菌前的带菌量；D121℃：在121℃下杀灭90%微生物所需时间。★防范措施：①制定日常操作的规范并严格执行。②直接与药品有接触的操作应带无菌手套并频繁冲洗，操作过程中动作不宜过大。③加强对微生物知识的了解，增强无菌操作意识。环境与微生物环境中的微生物种类繁多，主要有附着于尘埃上的从地面飞起的球菌属（包括八叠球菌属在内的好氧菌）；形成孢子的好氧性杆菌（如枯草芽孢杆菌）；青霉等霉菌的孢子等。微生物的存在严重影响着药品生产的安全，依次必须加以严格控制。新版GMP对洁净区微生物的动态要求★防范措施：1.合理的厂房布局及高效的空气过滤系统2.完善的洁净区日常卫生管理3.每周进行空气消毒(臭氧熏蒸)4.定期对洁净环境进行监测谢谢！JUSTDOIT！