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Sample&AssayTechnologies-1-核酸提取方法的进展——从经典方法到硅膜吸附法、硅胶磁珠分离法——从手工提取到自动化提取凯杰生物陈永亮Sample&AssayTechnologies-2-核酸提取方法的分类：按照提取原理分：经典方法有煮沸裂解法、酚-氯仿提取法，新方法有硅膜吸附法、磁珠分离法等按照提取方式分：手工提取和自动化提取Sample&AssayTechnologies-3-1953DNAstructuredetermined&publishedDNA结构被发现PurificationofDNAwithultracentrifuge超高速离心法提取DNAPhenolChloroformExtractions酚-氯仿提取法1993QIAGENintroducesthespincolumn凯杰引入硅胶膜柱技术核酸纯化方法的发展Sample&AssayTechnologies-4-经典手工提取方法：煮沸裂解法：一般用于DNA的手工提取，分为一步法和两步法，一步法得到的DNA含有较多小分子抑制物。两步法是第一步在样本中加入沉淀剂后离心弃上清，以去除小分子抑制物并沉淀病毒颗粒；第二步加入裂解液后煮沸，以释放DNA及沉淀残留蛋白等大分子抑制物，离心取上清即为得到的DNA。酚-氯仿提取法：一般用于RNA的手工提取，先在样本中加入裂解液，再加入氯仿后离心，以释放RNA并使之与蛋白层分离，再将上清液加入到异丙醇中以萃取RNA，离心后弃上清，加入乙醇洗涤后即为得到的RNA。Sample&AssayTechnologies-5-硅胶膜法硅胶磁珠法QIAGENSolutions（凯杰的解决方案）核酸提取的新方法Sample&AssayTechnologies-6-离液盐的作用溶解多聚糖胶改变水的结构，帮助核酸结合到硅胶膜上变性蛋白和核酸Sample&AssayTechnologies-7-CarrierRNA的作用确保对低滴度病毒RNA的回收效率保护病毒RNA，降低其被RNase的概率减少管壁对病毒RNA的吸附Sample&AssayTechnologies-8-二氧化硅分离核酸DNA水分子Sample&AssayTechnologies-9-ChaotropicSalt二氧化硅分离核酸Sample&AssayTechnologies-10-Silica二氧化硅分离核酸Sample&AssayTechnologies-11-二氧化硅对核酸的吸附和洗脱核酸(水相)核酸(吸附于硅胶膜)吸附离液盐乙醇低PH洗脱无离液盐低盐高PHSample&AssayTechnologies-12-硅胶膜法：可用于手工提取，也可用于自动化提取结合洗涤纯化的核酸备用洗脱裂解样品Lysis（裂解）n破坏蛋白质外壳，释放核酸Bind（结合）n核酸被二氧化硅捕获Wash（洗涤）n通过用不同的缓冲液洗涤，去除蛋白质等不需要的杂质Elute（洗脱）n将结合在二氧化硅上的核酸洗脱Sample&AssayTechnologies-13-磁珠分离法：一般用于自动化提取裂解Lysis（释放核酸）结合Bind（核酸特异性的吸附到磁珠外包被的硅胶模上）洗涤Wash（磁珠被移液枪头外的磁铁固定，洗涤去除杂质）洗脱Elute（通过改变PH值、离液盐等条件将核酸从磁珠外包被的硅胶模上洗脱下来）Sample&AssayTechnologies-14-裂解结合洗涤洗脱Sample&AssayTechnologies-15-硅胶吸附技术的优点n彻底去除抑制物：无乙醇、有机物等n灵活使用：离心、真空抽滤均可n简单稳定：裂解、结合、洗涤、洗脱四步，对操作要求低，重复性好n易于实现自动化n高效：95%以上的核酸得率Sample&AssayTechnologies-16-HCV---核酸提取v硅胶膜柱核酸Ø极大地降低了实验操作的技巧要求Ø结果重复性更好Ø纯化产物纯度更高，稳定性更好Ø纯化产物的量（60ul）可用于多次PCR扩增检测，无需重新提取核酸。Sample&AssayTechnologies-17-Ø手工离心Ø真空抽滤（QIAvac系统）Ø全自动核酸纯化（QIAcube）一种核酸纯化试剂，三种操作方式Sample&AssayTechnologies-18-QIAvac系统组成+QIAvac24PlusVacuumPumpQIAvacConnectingSystemSample&AssayTechnologies-19-QIAvac系统工作示意图VacConnectorVacValveColumnq操作简便，与手工离心方式相比，节省了大量繁琐的手工操作q省时，减少离心时的等待时间q真空抽滤与手工操作在实验结果上有很好的一致性Sample&AssayTechnologies-20-硅胶膜（离心法）自动核酸提取仪QIACUBE:一次可提取1～12个样本，使用的试剂与手工提取的试剂通用全球第一台离心式的全自动纯化设备Sample&AssayTechnologies-21-硅胶膜（负压法）自动核酸提取仪精巧(smart)简洁(compact)经济(affordable)QIAxtractor一次可提取96个样本，高性价比Sample&AssayTechnologies-22-硅胶膜（负压）自动核酸提取仪MDX：高端自动纯化系统，一次可提取96个样本Sample&AssayTechnologies-23-主要特色全过程自动化；使用创新的预装试剂盒，最少化设置时间；每次可处理1-96个样本，满足不同通量的要求；全自动纯化DNA，RNA，病毒核酸和蛋白；可处理高达1ml大体积样本，实现更高的灵敏度和产量；灵活的系统，可在操作过程中装载样本；条形码扫描，实现样本和试剂的全程追踪与记录；单次运行中可使用2种不同的试剂盒和程序；功能扩展的无限可能….应用范围基因表达分析基因分型蛋白组学常规分子生物学测序项目硅胶磁珠分离式自动核酸提取仪——QIAsymphony