同源克隆结合RACE技术扩增基因全长

同源克隆结合RACE技术扩增基因全长同源克隆这是一种参考其他物种的已知基因序列克隆待研究物种目标基因的方法。目前很多植物基因的序列信息已经公布，当克隆类似基因时可先从基因文库中找到相关基因序列，经比对后设计简并引物，然后通过的PCR方法进行克隆。同源克隆如果计划克隆的基因在本物种中已经有报道,那么只需要在NCBI网站上的Nucleotide数据库中检索到该基因序列,随后设计基因特异引物进行PCR扩增即可.如果计划克隆的目的基因在本物种中未见报道,则可以以近源物种中报道的该基因序列检索数据库,看是否能够比对到本物种的公布序列,从而设计基因特异引物进行PCR扩增.如果无法比对到本物种的表达序列,那么只有比对近源物种中所报道的该基因序列从而设计基因简并引物进行PCR扩增.同源克隆根据实验要求和目的不同,有时只需要得到基因片段,有时则需要得到基因全长.gDNA基因全长:cDNA基因全长:同源克隆如果需要得到基因全长,在克隆本物种中未见报道的基因时还需结合染色体步移,全长cDNA文库筛选或是RACE（Rapid-amplificationofcDNAends）技术等方法.RACE(Rapid-AmplificationofcDNAEnds)技术基因同源克隆实例二球悬铃木PaFT基因的克隆从营养生长转向生殖生长是植物一生中最重要的变化。70年前，经典的植物生理学实验证明了叶片是植物感受外界光信号的器官，但花的诱导则发生在植物的茎尖，所以植物生理学界提出了一个″开花素″(Florigen)的概念，认为有一种诱导开花的物质从叶片转运到茎尖而诱导开花。科学家们一直致力于寻找并证明这种物质的存在，但均以失败而告终FT/TFL基因家族随着分子生物学的发展，逐步在模式植物拟南芥中发现一系列基因参与了植物对外界光信号的感应。拟南芥对于长光照的反应依赖Constans(CO)基因，但CO基因只能在叶片中诱导开花，而不能在茎尖中直接诱导开花。CO基因促进开花的作用又进一步依赖于其下游基因FT。有人通过构建FT基因的诱导性表达载体，发现只需要在一个叶片中诱导FT表达就足以促使植株开花，同时证明了FT蛋白可以从叶片转运到茎尖生长点。这是首次从分子水平证实了开花素的存在。FT/TFL基因家族杨树是木本模式植物，自然界中杨树要生长20年左右才能开花。组成型表达的FT同源基因可以诱导杨树提前开花，转FT同源基因的杨树可以在转化后四周内即组织培养阶段开花。该成果可以广泛应用于多年生木本植物上从而加快常规育种进程.二球悬铃木PaFT基因的克隆悬铃木科现存只有1属—悬铃木属,大约6-10种，悬铃木属物种在分子方面的研究较为缺乏,数据库中的基因数据有限,因此根本不存在基因数据很全的近源物种,使得基因克隆难度大大增加.在设计FT同源基因的简并引物时,首先从NCBI中检索了约10个双子叶物种的FT同源基因序列,重点参考其中的四个木本植物FT同源序列设计简并引物.序列比对使用的软件是VectorNTI9.0,也可以使用DNAman或是DNAstar等软件.悬铃木FT基因的克隆(同源克隆)一.比对氨基酸序列悬铃木FT基因的克隆二.比对cDNA序列悬铃木FT基因的克隆三.简并引物设计,扩增保守片段FT1F:5’ACTYTGGTHATGGTKGAYCCWGAYG3’FT2F:5’CAYTGGTTRGTBACHGATATHCCWGC3’FTR:5’GRCARTTRAARWARACRGCRGCMACHGG3’PCR扩增基本程序1.94℃,4min2.94℃,30s3.60℃,30s4.72℃,1min5.Gotostep2,34cycle6.72℃,10min7.12℃,1h悬铃木PaFT基因的克隆四.模板准备要求:提取高质量的DNA和RNA悬铃木FT基因的克隆五.根据所得到的300bp片段设计Race反应的基因特异引物设计特异引物使用的软件是PrimerPremier5.00扩增片段经测序比对之后证实是PaFT基因的5’末端和3’末端悬铃木FT基因的克隆六,根据Race反应所得到的FT5’3’UTR序列设计基因特异引物,分别以gDNA和cDNA为模板进行PCR扩增,从而得到了FT基因的全长.注意事项设计同源克隆的引物时，要控制引物的简并度。设计RACE反应的特异引物时，引物的退火温度尽量控制在≥62℃。（常规引物的设计要点：引物长度控制在15-28bp之间，ATCG四种碱基的尽量分布均衡，尽量保证引物3’端的特异性，引物3’末端尽量不要出现连续的CCC或GGG，引物最好不要以A作为末尾，要避免形成发卡结构或二聚体）注意事项进行同源克隆时，最好设计扩增的目的条带存在50bp以上的长度差异的嵌套引物。注意事项进行同源克隆或是RACE扩增时，一定要做单引物对照。注意事项构建cDNA文库（cDNA双链模板）时，选材一定要仔细（组织部位，发育时期）。做实验要有耐心，要越挫越勇。当RACE实验进展不顺利时，尝试调整PCR程序中的引物退火温度以及循环数。