生物化学问答题

生物化学问答题（1）试举例比较蛋白质、核酸各自结构与其功能的相互关系。血红蛋白由4个亚基（多肽链）组成，每个亚基都有一个血红素基。血红蛋白以两种可以相互转化的构象态存在，称T（紧张态）和（R松弛）态。T态是通过几个盐桥稳定的，无氧结合时达到最稳定。氧的结合促进T态转变为R态。氧与血红蛋白的结合是别构结合行为的一个典型例证。T态和R态之间的构象变化是由亚基—亚基相互作用所介导的，它导致血红蛋白出现别构现象。Hb呈现出3种别构效应。第一，血红蛋白的氧结合曲线是S形的，这意味着氧的结合是协同性的。氧与一个血红素结合有助于氧与同一分子中的其他血红素结合。第二，H+和CO2促进O2从血红蛋白中释放，这是生理上的一个重要效应，它提高O2在代谢活跃的组织如肌肉中的释放。相反地，O2促进H+和CO2在肺泡毛细血管中的释放。H+、CO2和O2的结合之间的别构联系称为Bohr效应。第三，血红蛋白对O2的亲和力还受2、3-二磷酸甘油酸（DPG）调节，DPG是一个负电荷密度很高的小分子。BPG能与去氧血红蛋白结合，但不能与氧合血红蛋白结合。因此，BPG是降低血红蛋白对氧的亲和力的。氧的S形曲线结合，波尔效应以及DPG效应物的调节使得血红蛋白的输氧能力达到最高效应。同时由于能在较窄的氧分压范围内完成输氧功能，因此使肌体的氧水平不致有很大的起伏。此外血红蛋白使肌体内的pH也维持在一个较稳定的水平。血红蛋白的别构效应充分地反映了它的生物学适应性、结构与功能的高度统一性。（2）试述G蛋白信号转导系统的作用机理G蛋白即GTP结合蛋白，亦称核苷酸调节蛋白（N蛋白），是一种与膜受体偶联的异三聚体结合蛋白，其具有与GTP结合并催化GTP水解成GDP的能力，由α、β、γ三个亚基组成，充当细胞膜上受体和靶酶之间的信号传递体。另外还发现一种分子量较小的“小G蛋白（smallGTP-blindingprotein）”，其特点是它们都是单体，存在于不同的细胞部位，在细胞信号传递中也扮演着重要角色。G激素蛋白信号转导系统的作用机理有两种：一是各种含氮激素作为第一信使与靶细胞膜中的特异受体结合，使G蛋白活化，进而再使cAMP酶活化，催化ATP形成cAMP，作为第二信使的cAMP经一系列的相关反应级联放大，即先激活细胞内的蛋白激酶A（PKA），再进一步诱发各种功能单位产生相应的反应，cAMP起着信息的传递和放大作用；即跨膜信号传送。二是激素通过结合到细胞表面的激素受体上，激活G蛋白，G蛋白开启磷酸肌醇酶的催化活性，通过导致磷酸肌醇的级联放大而起作用，从而在许多种细胞种引起广泛的不同反应。在磷酸肌醇酶催化下先产生二酰基甘油（DAG）和肌醇三磷酸（IP3）。DAG进一步活化蛋白激酶C（PKC），促使靶蛋白质中的苏氨酸残基与丝氨酸残基磷酸化，最终改变一系列酶的活性；IP3则打开Ca2+通道，升高细胞质内Ca2+浓度，改变钙调蛋白和其他的钙传感器的构象，使之变得更易于与其靶蛋白质结合改变；即胞内信号传送。（3）DNA半保留复制的机理是通过哪些重要实验证明的？该复制方式的揭示有何重要意义？1958年Meselson和Stahl利用氮的同位素15N标记大肠杆菌DNA，首先证明了DNA的半保留复制。他们让大肠杆菌在以15NH4Cl为唯一氮源的培养基上生长，连续培养12代，从而使所有DNA都标记上15N。15N-DNA的密度比普通14N-DNA的大，在氯化铯密度梯度离心时，这两种DNA形成不同的条带。如果将15N标记的大肠杆菌转移到普通培养基（含14N的氮源），经过一代后，所有DNA的密度都介于15N-DNA和14N-DNA之间，即形成了一半含15N一半含14N的杂合分子；两代后14N和14N—15N杂合分子等量出现。若现培养，可以看到14N分子增多。当把14N—15N杂合分子加热时，它们分成14N链和15N链。这就充分证明了，在DNA复制时原来的DNA分子被分成了两个亚单位，分别构成子代分子的一半，这些亚单位在经过很多代后仍然保持完整。1963年，Cairns用放射自显影的方法第一次观察到完整的正在复制的大肠杆菌染色体DNA。他用这种方法阐明了大肠杆菌染色体DNA是环状分子，并以半保留的方式进行复制。DNA的半保留复制机制可以说明DNA在代谢上的稳定性。经过许多代的复制，DNA的多核苷酸链仍可保持完整，并存在于后代而不被分解掉。DNA与细胞其他成分相比要稳定得多，这和它的遗传功能是相符合的。但是这种稳定性是相对的，DNA在代谢上并不是完全惰性的物质。在细胞内外各种物理、化学和生物因子的作用下，DNA会发生损伤，需要修复；在复制和转录过程中DNA也会有损耗，而必须更新。从进化的角度看，DNA更是处于不断的变异和发展之中。（4）为什么分子筛层析和SDS-PAGE都可用蛋白质分子量的测定，其原理有何不同？因为不同的蛋白质，由于分子量不同，其分子大小、形状和所带电荷也不同，因此可以用分子筛层析和SDS-PAGE法测定其分子量。分子筛层析也称凝胶过滤法，其原理是：当不同分子大小的蛋白质流经凝胶层析柱时，比凝胶孔径大的分子不能进入珠内网状结构，而被排阻在凝胶珠之外随着溶剂在凝胶珠之间的孔隙向下移动并最先流出柱外；比网孔小的分子能不同程度地自由出入凝胶珠的内外。这样由于不同大小的分子所经的路径不同而得到分离，大分子物质先被洗脱出来，小分子物质后被洗脱出来。从凝胶过滤的原理可知，蛋白质分子通过凝胶柱的速度并不直接取决于分子的质量，而是它的斯托克半径。如果某种蛋白质与一理想的非水化球体具有相同的过柱速度，则认为这种蛋白质具有与此球体相同的半径，称蛋白质分子的斯托克半径。因此利用凝胶过滤法测定蛋白质相对分子质量时，标准蛋白质和待测蛋白质必须具有相同的分子形状（接近球体），否则不能得到比较准确的结果，分子形状为线形的或与凝胶能发生吸附作用的蛋白质，则不能用此方法测定分子量。SDS-PAGE也称SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，其原理是：以聚丙烯酰胺为支持物，用十二烷基硫酸钠（SDS）将蛋白质变性，由于蛋白质所带电荷、形状和大小不同，在电场作用下其迁移速率也不同，可以根据这些性质测定蛋白质的分子量。如果在聚丙烯酰胺凝胶系统中加入阴离子去污剂SDS和少量巯基乙醇，则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的相对分子质量，而与原来所带的电荷和分子形状无关。SDS是一种有效的变性剂，它能破裂蛋白质分子中的氢键和疏水作用，而巯基乙醇能打开二硫键，因此在有SDS和巯基乙醇存在下，单体蛋白质或亚基的多肽链处于展开状态。由于SDS是阴离子，使多肽链覆盖上相同密度的负电荷，该电荷量远超过蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同蛋白质间原有的电荷差别，结果所有的SDS—蛋白质复合体，电泳时都以同样的电荷／蛋白质质量比向正极移动。SDS凝胶电泳可看成是以电场为驱动力代替溶剂流动。而且SDS改变了蛋白质单体分子的构象，不同蛋白质的SDS复合体的短轴长度都是一样的。（5）核酸杂交技术的理论基础是什么？举例说明其在生命科学研究中的作用核酸由磷酸、碱基和戊糖组成，分DNA和RNA，分别有四种碱基，DNA为A、T、C、G，RNA为A、T、U、G。A与T、C与G、A与U配对，形成氢键，而且核酸具有变性和复性的性质，因此将不同来源的DNA放在试管里，经热变性后，慢慢冷却，让其复性。核酸杂交的实质是以DNA变性和复性为理论基础的。若这些异源DNA之间在某些区域具有相同的序列，则在复性时，会产生杂交DNA分子。与互补的RNA之间也可能发生杂交。分子杂交是分子生物学研究的重要方法。在科学研究中的应用：①亲缘关系的检测；②构建DNA分子的遗传圈，以进行目的基因的序列测定，满足基因克隆的特殊要求；③了解和掌握DNA分子中基因编码区的大小和位置；④核酸定量测量Ⅰ.检测核酸混合物中某种特殊DNA（或RNA）序列的相对含量；Ⅱ.可对核酸斑点印迹或狭线印迹的相应杂交信号作定量分析；Ⅲ.可测目的基因在某种特定组织中或培养细胞中的相对表达强度；⑤应用核酸杂交技术可将极少的真核细胞基因组中的单拷贝基因“钩”出来。例如重组体的筛选。DNA重组后，可以用核酸杂交技术将需要的重组体筛选出来。其方法是：将生长在平碟上的菌落转移到硝酸纤维素滤膜上，然后用NaOH处理膜上的菌落，使菌落裂解，使DNA变性并释放到纤维素膜上。将膜在80℃烘干4—6小时，使DNA牢固地吸附在膜上。将纤维素膜与放射性同位素标记的探针在封闭的塑料袋内进行杂交。杂交液中一个极重要的因素是盐的浓度。探针可以是一小段与所要筛选的DNA互补的DNA或RNA。杂交一般要维持一个晚上，然后用一定离子强度的溶液将非专一结合的，仅仅是吸附在膜上的放射性物质除去，再烘干纤维素膜，进行放射自显影。从显影后的底片上，可以显示出曝光的黑点，即代表杂交上的菌落。再按底片上菌落的位置找出培养基上相应的菌落，将它扩大培养后，制备出质粒DNA，作进一步分析。在分子遗传上，也可以利用分子杂交技术将目的DNA筛选出来。（6）DNA重组体的筛选方法（试述三种直接或间接方法，以证明某种外源基因已在转基因生物中存在或表达）1.插入失活。由于质粒中含有抗氨苄青霉素基因和抗四环素基因，在这些位点上如插入DNA片段后，相应的抗菌素基因被破坏，宿主细胞失去相应的抗药性致使其在含有该种抗菌素的培养基上不能生长。这一现象称插入抑制，利用插入抑制，很易将带有外源DNA的重组体筛选出来。例如，在抗氨苄青霉素位点插入外源DNA后，宿主细胞因失去对氨苄青霉素的抗性，不能在含有氨苄青霉素的培养基上生长，但仍能在含有四环素的培养基上生长。而不带外源DNA的野生型质粒的宿主细胞可以在含有两种药物的培养基上生长。这样，利用含有不同抗菌素的培养基可以很容易地将含有重组质粒（即带有外源DNA的质粒）的细菌筛选出来。2.菌落杂交。将生长在平碟上的菌落转移到硝酸纤维素滤膜上，然后用NaOH处理膜上的菌落，使菌落裂解，使DNA变性并释放到纤维素膜上。将膜在80℃烘干4—6小时，使DNA牢固地吸附在膜上。将纤维素膜与放射性同位素标记的探针在封闭的塑料袋内进行杂交。杂交液中一个极重要的因素是盐的浓度。探针可以是一小段与所要筛选的DNA互补的DNA或RNA。杂交一般要维持一个晚上，然后用一定离子强度的溶液将非专一结合的，仅仅是吸附在膜上的放射性物质除去，再烘干纤维素膜，进行放射自显影。从显影后的底片上，可以显示出曝光的黑点，即代表杂交上的菌落。再按底片上菌落的位置找出培养基上相应的菌落，将它扩大培养后，制备出质粒DNA，作进一步分析。3、免疫学方法。如果插入的外源DNA经表达后产生蛋白质，亦可以用免疫学的方法加以筛选。固体培养基上由菌落所产生的蛋白质，可以转移到硝酸纤维素膜上。然后用相应的放射性标记的抗体进行反应。洗去非特异性吸附的放射性后，用放射自显影显示结果。（7）阐述电泳法分离同工酶的原理？为什么用聚丙烯酰胺凝胶电泳可得到较好的效果？1．同工酶指催化相同的化学反应，但其蛋白质分子结构、理化性质和免疫性能等方面都存在明显差异的一组酶，分为原级同工酶和次级同工酶。对于同一种酶，其表面电荷是相同的，而对于同工酶，其表面电荷常常不同，在电场作用下，其迁移速率也不同，因此可以用电泳法分离。2．电泳是指带电颗粒在电场的作用下，向着与其电性相反的电极移动的现象，称为电泳。带电颗粒在电场中的泳动速度与本身所带净电荷的量、颗粒大小和形状有关，同时还受其它外界因素如电场强度、溶液的pH值、溶液的离子强度、电渗、支持物等等影响。一般来说，物质所带的净电荷量越多，颗粒越小，形状越接近球形，则在电场中泳动速度越快；反之则慢。由于同工酶彼此之间的理化性质如：所带电荷、形状、分子大小有差异。加之它们是蛋白质，具有许多可解离的酸碱基团，是典型的两性电解质，在一定的pH条件下，就会解离而带电，进行电泳时就呈现不同的移动状态，从而将同工酶进行分离，并通过染色等处理就清晰可见，进行鉴别。3．聚丙烯酰胺凝胶电泳简称PAGE，也称圆盘凝胶电泳或圆盘电泳，它是在区带电泳的基础上发展起来的。它以聚丙烯酰胺凝胶为支持物，一般制成凝胶柱