石蜡切片免疫组化及免疫荧光染色方法

石蜡切片免疫组化及免疫荧光染色方法1、组织的采集、固定和保存：采取组织后，方法一：4%多聚甲醛（4%PFA）4C固定1小时（根据组织大小和致密程度调整固定时间）或过夜方法二：采用bouin’s固定RT2h（6-8dtesis）orRT过夜（成年tesis）PBS缓冲液洗三次，每次5min，4C保存于70%乙醇中。2、组织的包埋、切片、展片及保存：：固定后的样品经梯度乙醇脱水、二甲苯透明，52-54C石蜡包埋，常规切片，切片厚4-10m，贴于处理过的干净载玻片上，37C烤片过夜，之后收集于载片盒中，RT密封保存。石蜡包埋：保存于4C70%乙醇中的组织样品80%乙醇15min95%乙醇15min100%乙醇15min21/2乙醇1/2二甲苯15min二甲苯透明5-10min1/2二甲苯1/2石蜡30min石蜡（1）1.5hr石蜡（2）1.5-2.5hr石蜡（3）包埋RT保存3、石蜡组织切片的免疫组化方法：密封保存于RT的组织切片二甲苯(1)20min二甲苯(2)20min100%乙醇20min95%乙醇10min80%乙醇10min通风橱晾干，阻水笔在组织周围画圈切片在PBS中浸泡5min*20.4%TritonxRT10min切片在PBS中浸泡5min*33%H2O2RT10min切片在PBS中浸泡5min*30.25%胰酶RT10min切片在PBS中浸泡5min*3Blockingbuffer(3%BSA+5%NGS+0.2%Tritonx-100inPBS)RT60min倾去blockingbuffer，勿洗一抗4Covernightinblockingbuffer取出切片复温1h，切片在PBS中浸泡5min*3二抗inblockingbufferGAR1：200（GAM1：100），RT1h切片在PBS中浸泡5min*3DAB显色5-10min（50微升A+50微升B+900微升PBS+5微升3%H2O2）如果是增强型DAB只要1min即可。切片浸入PBS终止显色，HE衬染1s，玻片架放入泡沫盒，流水冲洗15min，肉眼看到淡淡的紫色即可停止。若颜色太深，可用0.1-0.5%盐酸乙醇分色1～2秒钟（或更久）脱水85%乙醇5min95%乙醇5min无水乙醇5min无水乙醇5min二甲苯(1)10min二甲苯(2)10min中性树胶封片，室温干燥保存4、石蜡组织切片的免疫荧光方法：密封保存于RT的组织切片二甲苯(1)20min二甲苯(2)20min100%乙醇20min95%乙醇10min80%乙醇10min通风橱晾干，阻水笔在组织周围画圈切片在PBS中浸泡5min*20.4%TritonxRT10min切片在PBS中浸泡5min*3切片在PBS中浸泡5min*30.25%胰酶RT10min切片在PBS中浸泡5min*3Blockingbuffer(3%BSA+5%NGS+0.2%Tritonx-100inPBS)RT60min倾去blockingbuffer，勿洗一抗4Covernightinblockingbuffer取出切片复温1h，切片在PBS中浸泡5min*3荧光二抗inblockingbufferGAR-cy31：1000，GAM-4881：1000RT1hDAPI（1：1000请根据二抗说明稀释二抗）切片在PBS中浸泡5min*3moil封片，避光4C保存