pGEM-T和pGEM-T-Easy载体系统

注意：本中文操作手册仅供实验参考，在实际使用中请详细对照原英文技术手册TM042。如遇到问题请与Promega公司北京办事处联系，TEL:[phone]；E-mail:[e-mail]技术手册号码：CTM042第1页共23页pGEM®-T和pGEM®-TEasy载体系统原英文技术手册号码：TM042产品A1360，A1380，A3600和A3610的操作指南。所有技术资料均可在网站上得到，请访问公司网站以证实您所使用的技术手册为最新版本I.描述……………………………………………………………………………………..2II.载体图谱………………………………………………………………………………..3III.产品组分……………………………………………………………………………..6IV.采用pGEM®-T和pGEM®-TEasy载体和2×快速连接缓冲液进行连接……….7A.操作步骤…………………………………………………………………………7V.采用pGEM®-T和pGEM®-TEasy载体的连接反应产物的转化………………...7VI.注意事项…………………………….……………………………………………….8A.PCR产物纯度…………………………………………………………………...8B.平端PCR产物…………………………………………………………………9C.优化插入片段与载体的摩尔比…………………………………………………10D.有插入片段的转化子的筛选……………………………………………………11E.实验对照………………………………………………………………………...11VII.重组质粒DNA的提取…………………………………………………………….…12VIII.pGEM®-T和pGEM®-TEasy载体单链DNA的制备….…………………………12IX.疑难解答………………………………………………………………………………13X.参考文献………………………………………………………………………………15XI.附录A：载体序列及限制性酶切位点………………………………………………16A.pGEM®-T载体序列………………………………………………………………16B.pGEM®-T载体限制性酶切位点…………………………………………………17C.pGEM®-TEasy载体序列……………………………………………………….18D.pGEM®-TEasy载体限制性酶切位点………………………………………….19XII.附录B：参考资料…………………………………………………………………..21A.缓冲液及溶液配方………………………………………………….…...………21B.相关产品…..……….……………………………………………….…...………22注意：本中文操作手册仅供实验参考，在实际使用中请详细对照原英文技术手册TM042。如遇到问题请与Promega公司北京办事处联系，TEL:[phone]；E-mail:[e-mail]技术手册号码：CTM042第2页共23页I.描述pGEM®-T和pGEM®-TEasy载体系统可用于PCR产物的克隆。这两种载体是通过EcoRⅤ酶切pGEM®-5Zf(+)和pGEM®-TEasy载体，并在3’末端加入胸腺嘧啶构建的。插入位点3’-T突出端可提高PCR产物的连接效率，因为3’-T突出端可以防止载体的自身环化，并且为热稳定性聚合酶（1，2）产生PCR产物提供一个匹配碱基。如表1总结的，这些聚合酶常常以不依赖模板方式在扩增产物的3’端加上一个脱氧腺苷酸（3，4）。pGEM®-T和pGEM®-TEasy高拷贝数载体包含有T7和SP6RNA聚合酶启动子，其侧翼和多克隆位点区相接，多克隆位点区位于β半乳糖苷酶的α肽编码区内。α肽插入失活允许在指示培养基用颜色直接筛选重组克隆。另外这两个载体的多克隆位点区的限制性酶切位点适用于采用Promega公司Erase-a-Base®系统（产品目录号#E5750）产生一系列巢式缺失体。pGEM®-T和pGEM®-TEasy载体的多克隆位点区含有一些这样的限制性酶切位点，采用这些酶进行单酶切消化即可释放插入片段。如pGEM®-TEasy载体多克隆区的EcoRⅠ、BstZⅠ和NotⅠ酶切位点。而pGEM®-T载体多克隆区只有一种这样的酶切位点BstZⅠ。这两种载体也可选用适当的双酶切消化释放插入片段。pGEM®-T和pGEM®-TEasy载体含有丝状噬菌体f1复制起始子，可用于制备单链DNA(ssDNA参见第Ⅶ部分)。单链DNA分子对应于图1底部一条链，图一中上图代表pGEM®-T载体，下图代表pGEM®-TEasy载体。pGEM®-T和pGEM®-TEasy载体系统包含2×快速连接缓冲液，用于连接PCR产物。采用这种缓冲液进行连接，在室温孵育1小时即可完成。延长孵育时间可增加转化克隆菌数目。一般4℃过夜连接可产生最多的转化子。表1.部分热稳定性DNA聚合酶所产生的PCR产物特性的比较。热稳定性DNA聚合酶特性Taq/AmpliTaq®TflTthVent®/(Tli)DeepVent®PfuPwoPCR产物末端3’A3’A3’A95%平端95%平端平端平端5’-3’外切酶活力有有有无无无无3’-5’外切酶活力无无无有有有有注意：本中文操作手册仅供实验参考，在实际使用中请详细对照原英文技术手册TM042。如遇到问题请与Promega公司北京办事处联系，TEL:[phone]；E-mail:[e-mail]技术手册号码：CTM042第3页共23页II.载体图谱A.pGEM®-T载体和pGEM®-TEasy载体多克隆位点序列pGEM®-T载体图1.pGEM®-T和pGEM®-TEasy载体的启动子及多克隆位点区序列。上部序列链对应于用T7RNA聚合酶合成的RNA序列，底部序列链对应于用SP6RNA聚合酶合成的RNA序列。注意：用BstZI(Cat.#R6881)单酶切可释放插入pGEM®-T载体的DNA片段。注意：用BstZI(Cat.#R6881),EcoRI(Cat.#R6o11)或NotI(Cat.#R6431)进行单酶切可释放插入pGEM®-TEasy载体的DNA片段。注意：本中文操作手册仅供实验参考，在实际使用中请详细对照原英文技术手册TM042。如遇到问题请与Promega公司北京办事处联系，TEL:[phone]；E-mail:[e-mail]技术手册号码：CTM042第4页共23页可使用SP6PromoterPrimer(Cat.#Q5011),T7PromoterPrimer(Cat.#Q5021),pUC/M13ForwardPrimer（Cat.#Q5601）,或pUC/M13ReversePrimer（Cat.#Q5421）对插入的DNA片段进行测序。注意：用BstZI(Cat.#R6881)单酶切可释放插入pGEM®-T载体的DNA片段。双酶切也可用于释放插入pGEM®-T载体的DNA片段。B.pGEM®-T载体图和相关序列位点图2.pGEM®-T载体环形图谱及相关的序列位点pGEM®-T载体相关的序列位点T7RNA聚合酶转录起始位点1多克隆位点区10－113SP6RNA聚合酶启动子（－17至＋3）124－143SP6RNA聚合酶转录起始位点126pUC/M13反向测序引物结合位点161－177lacZ起始密码子165lac操纵子185－201β内酰胺酶编码区1322－2182噬菌体f1区2365－2820lac操作子序列2821－2981，151－380pUC/M13正向测序引物结合位点2941－2957T7RNA聚合酶启动子（－17至＋3）2984－3注意：本中文操作手册仅供实验参考，在实际使用中请详细对照原英文技术手册TM042。如遇到问题请与Promega公司北京办事处联系，TEL:[phone]；E-mail:[e-mail]技术手册号码：CTM042第5页共23页C.pGEM®-TEasy载体图和相关序列位点图3.pGEM®-TEasy载体环形图谱及相关的序列位点pGEM®-TEasy载体相关的序列位点T7RNA聚合酶转录起始位点1多克隆位点区10－128SP6RNA聚合酶启动子（－17至＋3）139－158SP6RNA聚合酶转录起始位点141pUC/M13反向测序引物结合位点176－197lacZ起始密码子180lac操纵子200－216β内酰胺酶编码区1337－2197噬菌体f1区2380－2835lac操作子序列2836－2996,166－395pUC/M13正向测序引物结合位点2956－2972T7RNA聚合酶启动子（－17至＋3）2999－3pGEM®-T和pGEM®-TEasy载体的特殊应用1．PCR产物的克隆。2．采用Erase-a-Base®系统构建不定向巢式缺失体。3．单链DNA制备。4．重组子的蓝白斑筛选。5．利用双向启动子进行体外转录。（操作步骤详见Promega公司Riboprobe®体外转录技术手册＃TM016）。可使用SP6PromoterPrimer(Cat.#Q5011),T7PromoterPrimer(Cat.#Q5021),pUC/M13ForwardPrimer（Cat.#Q5601）,或pUC/M13ReversePrimer（Cat.#Q5421）对插入的DNA片段进行测序。注意：用BstZI(Cat.#R6881)单酶切可释放插入pGEM®-T载体的DNA片段。双酶切也可用于释放插入pGEM®-T载体的DNA片段。注意：本中文操作手册仅供实验参考，在实际使用中请详细对照原英文技术手册TM042。如遇到问题请与Promega公司北京办事处联系，TEL:[phone]；E-mail:[e-mail]技术手册号码：CTM042第6页共23页III．产品组成产品包装目录号pGEM®-T载体系统Ⅰ20个反应A3600包括：1.2µgpGEM®-T载体(50ng/µl)12µl插入DNA对照（4ng/µl）100UT4DNA连接酶200µlT4DNA连接酶的2×快速连接缓冲液1操作手册产品包装目录号pGEM®-T载体系统Ⅱ20个反应A3610包括：1.2µgpGEM®-T载体(50ng/µl)12µl插入DNA对照（4ng/µl）100UT4DNA连接酶200µlT4DNA连接酶的2×快速连接缓冲液1.2mlJM109高效率感受态细胞（6×200µl）1操作手册产品包装目录号pGEM®-TEasy载体系统Ⅰ20个反应A1360包括：1.2µgpGEM®-TEasy载体(50ng/µl)12µl插入DNA对照（4ng/µl）100UT4DNA连接酶200µlT4DNA连接酶的2×快速连接缓冲液1操作手册产品包装目录号pGEM®-TEasy载体系统Ⅱ20个反应A1380包括：1.2µgpGEM®-TEasy载体(50ng/µl)12µl插入DNA对照（4ng/µl）100UT4DNA连接酶200µlT4DNA连接酶的2×快速连接缓冲液1.2mlJM109高效率感受态细胞（6×200µl）1操作手册贮存条件：产品A1360和A1380中的感受态细胞保存在－70℃。所有其它组份可以保存在－20℃或－70℃。注意：本中文操作手册仅供实验参考，在实际使用中请详细对照原英文技术手册TM042。如遇到问题请与Promega公司北京办事处联系，TEL:[phone]；E-mail:[e-mail]技术手册号码：CTM042第7页共23页IV．采用pGEM®-T和pGEM®-TEasy载体以及2×快速连接缓冲液进行连接反应的步骤1．短暂