实验室常用技术参数资料

实验室常用技术参数资料一、核酸及蛋白质常用数据1．核苷三磷酸的物理常数化合物分子量λmax(pH7.0)1摩尔溶液（pH7.0）中λmax时的最大吸收值OD280/OD260ATP507259154000.15CTP48327190000.97GTP523253137000.66UTP484262100000.38dATP494259152000.15dCTP46727193000.98dGTP507253137000.66dTTP48226796000.712．常用核酸的长度与分子量核酸核苷酸数分子量λDNA48502（双链环状）3.0×107pBR3224363（双链）2.8×10628SrRNA48001.6×10623SrRNA37001.2×10618SrRNA19006.1×10519SrRNA17005.5×1055SrRNA1203.6×104tRNA（大肠杆菌）752.5×1043．常用核酸蛋白换算数据（1）重量换算1μg=10-6g1pg=10-12g1ng=10-9g1fg=10-15g（2）分光光度换算：1A260双链DNA=50μg/ml1A260单链DNA=30μg/ml1A260单链RNA=40μg/ml（3）DNA摩尔换算：1μg100bpDNA=1.52pmol=3.03pmol末端1μgpBR322DNA=0.36pmol1pmol1000bpDNA=0.66μg1pmolpBR322=2.8μg1kb双链DNA（钠盐）=6.6×105道尔顿1kb单链DNA（钠盐）=3.3×105道尔顿1kb单链RNA（钠盐）=3.4×105道尔顿（4）蛋白摩尔换算：100pmol分子量100，000蛋白质=10μg100pmol分子量50，000蛋白质=5μg100pmol分子量10，000蛋白质=1μg氨基酸的平均分子量=126.7道尔顿（5）蛋白质/DNA换算：1kbDNA=333个氨基酸编码容量=3.7×104MW蛋白质10，000MW蛋白质=270bpDNA30，000MW蛋白质=810bpDNA50，000MW蛋白质=1.35kb100，000MW蛋白质=2.7kbDNA4．常用蛋白质分子量标准参照物（1）高分子量标准参照（2）中分子量标准参照（3）低分子量标准参照肌球蛋白分子量磷酸化酶B97，400碳酸酐酶31，00肌球蛋白212，000牛血清白蛋白66，200大豆脻蛋白酶21，500β-半乳糖甘酶B116，000谷氨酶脱氢酶55，000抑制剂磷酸化酶B97，400卵白蛋白42，700马心肌球蛋白16，900牛血清白蛋白66，200醛缩酶40，000溶菌酶14，400过氧化氢酶`57，000碳酸酐酶31，000肌球蛋白（F1）8，100醛缩酶40，000大豆脻蛋白酶21，500肌球蛋白（F2）6，200抑制剂肌球蛋白（F3）2，500溶菌酶14，4005．常用DNA分子量标准参照物λDNA/HindⅢλDNA/EcoRⅠλ/HindⅢ+EcoRⅠpBR322/HaeⅢ23130212262122758712394167421514840510465575804497350489436156434268458802322484335304346420273530202726757564190423451125158421321137519218974184118311247564125续上表pBR322/HinfⅠφχ174/HinfⅠφχ174/HaeⅢφχ174/TapⅠ16317261401353291451771311810781175506553100872404396500826033273444176631023129841348281141221311422718722024940234541542002419433751511182072二、常用缓冲液1．分子克隆常用缓冲液2．磷酸缓冲液（1）25℃下0.1mol/L磷酸钾缓冲液的配制※pH1mol/LK2HPO4(ml)1mol/LKH2PO4(ml)5.88.591.56.013.286.86.219.280.86.427.872.26.638.161.96.849.750.37.061.538.57.271.728.37.480.219.87.686.613.47.890.89.28.094.06.2（2）25℃下0.1mol/L磷酸钠缓冲液的配制※pH1mol/LNa2HPO4(ml)1mol/LNaH2PO4(ml)5.87.992.16.012.088.06.217.882.26.425.574.56.635.264.86.846.353.77.057.742.37.268.431.67.477.422.67.684.515.57.889.610.48.093.26.8※:用蒸馏水将混合的两种1mol/L贮存液稀释至1000ml，根据Henderson-Hasselbalch方程计算其pH值：pH=pK’+1g([质子受体]/[质子供体])在此，pK’=6.86(25℃)。3．电泳缓冲液测序凝胶加样缓冲液98%去离子甲酰胺10mol/LEDTA(pH8.0)0.025%二甲苯青FF0.025%溴酚蓝甲酰胺：许多批号的试剂级甲酰胺，其纯度符合使用要求，无须再进行处理。不过，一旦略呈黄色，则应用在磁力搅拌器上将甲酰胺与DowexXG8混合床树脂共同搅拌1小时进行去离子处理，并用Whatman1号滤纸过滤2次，去离子甲酰胺分装成小份，充氮存于-70℃。常用的电泳缓冲液缓冲液使用液浓贮存液（每升）Tris-乙酸（TAE）1×：0.04mol/LTris-乙酸50×：242gTris碱0.001mol/LEDTA57.1ml冰乙酸100ml0.5mol/LEDTA(pH8.0)Tris-磷酸（TPE）1×:0.09mol/LTris-磷酸10×:10gTris碱0.002mol/LEDTA15.5ml85%磷酸（1.679g/ml）40ml0.5mol/LEDTA(pH8.0)Tris-硼酸（TBE）a0.5×0.045mol/LTris-硼酸5×：54gTris碱0.001mol/LEDTA27.5硼酸20ml0.5mol/LEDTA(pH8.0)碱性缓冲液b1×:50mmol/LNaOH1×:5ml10mol/LNaOH1mmol/LEDTA2ml0.5mmol/LEDTA(pH8.0)Tris-甘氨酸c1×:25mmol/LTris5×:15.1gTris250mmol/L甘氨酸94g苷氨酸（电泳级）（pH8.3）0.1%SDS50ml10%SDS(电泳级)说明：①TBE溶液长时间存放后会形成沉淀物，为避免这一问题，可在室温下用玻璃瓶保存5×溶液，出现沉淀后则予以废弃。以片都以1×TBE作为使用液（即1：5稀释浓贮液）进行琼脂糖凝胶电泳。但0.5×的使用液已具备足够的缓冲容量。目前几乎所有的琼脂糖胶电泳都以1：10稀释的贮存液作为使用液。进行聚丙烯酰胺凝胶垂直槽的缓冲液槽较小，故通过缓冲液的电流量通常较大，需要使用1×TBE以提供足够的缓冲容量。②碱性电泳缓冲液应现用现配。③Tris-甘氨酸缓冲液用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。2×SDS凝胶加样缓冲液：100mmol/LTris·HCl(6.8)200mmol/L二硫苏糖醇（DTT）4%SDS（电泳级）0.2%溴酚蓝20%甘油不含DTT的2×SDS凝胶加样缓冲液可保存于室温，应在临用前取1mol/L贮存液现加于上述缓冲液中。4．凝胶加样缓冲液缓冲液类型6×缓冲液贮存温度Ⅰ0.25%溴酚蓝4℃0.25%二甲苯青FF40%（W/V）蔗糖水溶液Ⅱ0.25溴酚蓝室温0.25%二甲苯青FF15%聚蔗糖(Ficoll400)Ⅲ0.25%溴酚蓝4℃0.25%二甲苯青FF30%甘油水溶液Ⅳ0.25%溴酚蓝4℃40%(W/V)蔗糖水溶液碱性加样缓冲液:300mmol/LNaOH6mmol/LEDTAⅤ18%聚蔗糖(Ficoll400)4℃0.15%溴甲酚绿0.25%二甲苯青FF使用以上凝胶加样缓冲液的目的有三：增大样品密度；以确保DNA均匀进入样品孔内；使样品呈现颜色，从而使加样操作更为便利，含有在电块中能以可预知速率向阳极泳动的染料。溴酚蓝在琼脂糖中移动的速率约为二甲苯青FF的2.2倍，而与琼脂糖浓度无关。以0.5×TBF作电泳液时，溴酚蓝在琼脂糖中的泳动速率约与长300bp的双链线状DNA相同，而二甲苯青FF的泳动则与长4kb的双链线状DNA相同。在琼脂糖浓度为0.5%～1.4%的范围内，这些对应关系受凝胶浓度变化的影响并不显著。选用哪一种加样染料纯属个人喜恶。但是，对于碱性凝胶应当使用溴甲酚绿作为示踪染料，因为在碱性pH条件下其显色较溴酚更蓝为鲜明。5．各种pH值的Tris缓冲液的配制各种pH值的Tris缓冲液的配制所需pH值（25℃）0.1mol/LHCl的体积7．145．77．244．77．343．47．442．07．540．37．638．57．736．67．834．57．932．08．029．28.126.28.222.98.319.98.417.28.514.78.612.48.710.38.88.58.97.0某一特定pH值的0.05mol/LTris缓冲液的配制：将50ml0.1mol/LTris碱溶液与上表所示相应体积（单位：ml）的0.1ml/LHCl混合，加水将体积调至100ml（2）温度对50mmol/LTris·HCl液pH值的影响4℃25℃37℃8．17．57．28．27．67．38．37．77．48．47．87．58．57．97．68．68．07．78．78．17．88．88．27．98．98．38．09．08．48．19．18．58．29．28．68．39．38．78．49．48．88．5（6）常用缓冲液的pKa值缓冲液分子量pKa值缓冲范围Trisa12.18.087.1～7.9HEPESb283.37.477.2～8.2MPOSc209.37.156.6～7.8PIPESd304.36.766.2～7.3MESe195.26.095.4～6.8a：三羟甲基氨基甲烷；b：N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磷酸；c：3-（N-吗啉代）丙磺酸；d：N，N’-双（2-乙磺酸）哌嗪；e：2-（N-吗啉代）乙磺酸。7．温度对常用缓冲液pH的影响缓冲体系pKa(20℃)△pKa/10℃Mes6.15-0.110Ada6.60-0.110PiPes6.80-0.085Aces6.90-0.200Bes7.15-0.160Mops7.20-0.013Tes7.50-0.200Hepes7.55-0.014Tricine8.15-0.210Tris8.30-0.310Bicine8.35-0.180Glycylglycine8.40-0.280三、常用酶的配制1．溶菌酶用水配制成50mg/ml的溶菌酶溶液，分装成小份并保存于-20℃。每一小份一经使用后便予丢弃。2．蛋白水解酶类贮存液贮存温度反应浓度反应缓冲液温度预处理0.01mol/LTris(pH7.8)链霉蛋白酶a20mg/ml-20℃（溶于水）1mg/ml0.01mol/LEDTA37℃自消化b0.5%SDS0.01mol/LTris(pH7.8)蛋白酶Kc20mg/ml-20℃（溶于水）50μg/ml0.005mol/LEDTA37～56℃无须预处理0.5%SDSa：链霉蛋白酶是从链球菌（Streptomycesgriseus）中分离到的一种丝氨酸酶和酸性蛋白酶的混合物。b：自消化可消除DNA酶和RNA酶的污染，经自消化的链酶蛋白酶的配制方法如下：把该酶的粉末溶解于10mmol./lTris·HCl(pH7.5)、10mmol/lNaCl中，配成20mg/ml浓度，于37℃温育1h。经消化的链霉蛋白酶分装成小份放在密封试管中，保存-20℃。c：蛋白酶K是一种枯草蛋白酶类的高活性蛋白酶，从林伯氏白色念