限制性内切酶

第二节基因克隆操作•意义•基因克隆常用工具•PCR•基因文库构建•基因的筛选与鉴定一、基因分离的意义•特有基因：生物进化，木本果树与草本植物不同，更复杂；目的不同，果树以生产果实为目的；多年生，控制更复杂，影响因素也更多。•通过分离的基因，对生理现象遗传控制的分子机理进行研究，这是无法以拟南芥代替的。例如，果树童期分子机理的研究。•互相促进，相辅相承。2.基因分离的工具就像在一堆稻草里寻找一根针一样，一段特殊DNA序列的分离过程十分困难。一般都需要在大肠杆菌扩增与表达。1973年Cohen完成第一个基因操作实验经体外重组获得杂合DNA杂合子转化入大肠杆菌所需元件：限制性内切酶连接酶载体受体细胞二、基因分离常用工具•①限制性内切核酸酶•②连接酶•③聚合酶•④载体•⑤受体细胞①限制性内切酶：1.About600commercialrestrictionenzymes.2.REwerediscoveredin1970sbyHamiltonSmithandDanielNathans.Theysharedthe1986NobelprizeinphysiologyorMedicinewithWernerArber.3.TypeIandTypeIIIoccupy1%respectively,TypeIIhavemorethan93%.II类限制性内切酶的特点1、有特定的识别序列，通常为4－6个碱基的回文对称序列。2、切割位点位于识别序列内的固定位置上，切割后在5’末端有磷酸基团，3’末端有羟基。3、切割后形成粘性末端或平末端，前者又分为3'突出端（如PstI）和5’突出端(如EcoRI)两种4、其活性发挥只需Mg2＋作辅酶。EcoRI:5’--NG3’5’AATTCN--3’3’--NCTTAA5’3’GN--5’BamHI:5’--NG3’5’GATCCN--3’3’--NCCTAG5’3’GN--5’EcoRV5’--NGATATCN--3’3’--NCTATAGN--5’5’--NGAT3’5’ATCN--3’3’--NCTA5’3’TAGN5--’5’--NGGATCCN--3’3’--NCCTAGGN--5’5’--NGAATTCN--3’3’--NCTTAAGN--5’②连接酶体外催化磷酸二酯键的形成可使用两种酶：大肠杆菌连接酶和T4噬菌体连接酶，但几乎在所有的克隆中T4噬菌体连接酶都是首选的酶，因其能在正常的反应条件下能有效的将平端连接起来。各种连接酶特性的比较：T4DNALigaseE.coliDNALigaseT4RNALigaseLigasesofthermophilicbacteria最适pH辅酶7.2-7.8ATP7.5-8.0NAD7.2-8.4ATPNAD平滑末端可能*不能NODNA5’P末端和RNA3’OH末端可能可能不能NORNA5’P末端和DNA3’OH末端可能不能不能NORNA和RNA少数可能不能可能NO③聚合酶•催化DNA的合成•E.coliDNA聚合酶I:聚合和外切活性用来切口平移标记，末端标记•KlenowDNA聚合酶：补平3’凹端，抹平3’凸端，随机引物标记。•耐热DNA聚合酶：TaqDNA聚合酶，VentDNA聚合酶，pfuDNA聚合酶。•反转录酶：AMV,MMuLV•T4/T7噬菌体DNA聚合酶载体必备条件：1.含有复制子，载体在受体细胞中能大量繁殖，其携带的外源基因才能在受体细胞中得到大量扩增；2.有1到几个限制内切酶的单一识别与切割位点，便于外源基因的插入；3.具有选择性的遗传标记(如抗生素抗性标记等)以此知道它是否已进入受体细胞，并据此标记将受体细胞从其他细胞中分离出来。④克隆载体载体类型•A.质粒载体•B.噬菌体载体•C.粘粒载体•D.BAC/YAC载体•E.其他质粒是染色体之外的一种稳定的遗传因子，具有自主复制和转录能力是双链闭合环状DNA分子大小在1－20kb之间它可独立游离于细胞质中，也可整合到细菌染色体上。质粒的基本特点标记基因•抗生素基因：四环素抗性基因Tetracycline氯霉素抗性基因Chloramphenical卡那霉素抗性Kanamycin新霉素抗性Neomycin氨苄青霉素Ampicillin•其他质粒转录载体λphage插入型载体噬菌体载体：置换型载体噬菌体载体•主要用于构建基因文库，特别是cDNA文库•主要步骤有①载体纯化；②载体与外源DNA的酶切；③连接；④重组噬菌体的体外包装；⑤感染；⑥筛选粘粒载体Cosmid•质粒的衍生物，是带有cos序列的质粒，cos序列是噬菌体DNA中的一段序列。•大小一般5-7kb,用来克隆35-45kb大小的片段BAC/YAC载体•细菌人工染色体BacterialAritificialChromosome•酵母人工染色体Yeast•操作比较困难，主要用于大片段DNA；如基因组文库⑤受体细胞1、定义：外源DNA导入的细胞，是重组体扩增的场所。2、要求：易于接纳外源DNA无特异的内源性核酸内切酶载体复制、扩增不受阻与载体有互补性3、细胞生长过程中有这样的时期。受体类型•原核：大肠杆菌，枯草杆菌，链霉菌，蓝藻等•真核：真菌：酵母、构巢曲霉；植物：原生质体、细胞、组织、器官动物：昆虫细胞、卵母细胞等分离基因用简单易于操作的受体；用于遗传信息的表达和功能研究则用真核生物受体细胞。DNA向宿主细胞的导入方法•CaCl2法：感受态细胞与质粒DNA热击法42C•电击法•基因枪法•病毒侵染•其他三、聚合酶链式反应（PCR）•聚合酶链式反应（Polymerasechainreaction）简称PCR技术，是一种体外扩增特异DNA片段的技术。•利用PCR技术可在短时间内获得数百万个特异的DNA序列的拷贝。•PCR技术实际上实在模板DNA、引物和4种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。•PCR技术的特异性取决于引物和模板DNA结合的特异性。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应做准备；②退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③延伸：DNA模板--引物结合物在Taq酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。标准的PCR反应体系•10×扩增缓冲液10ul•4种dNTP混合物各200umol/L•引物各10～100pmol•模板DNA0.1～2ug•TaqDNA聚合酶2.5u•Mg2+1.5mmol/L•加双蒸水至100ul四、基因文库•基因文库(genelibrary)则是指某一生物类型全部基因的集合，这种集合以重组形式出现。某生物DNA片段群体（对于核DNA是以限制性酶切后的群体）与载体分子重组，重组后转化宿主细胞，转化细胞在选择培养基上生长出的单个菌落（噬菌斑或成活细胞）是一个DNA片段的克隆，所有这些片段克隆的集合即是该生物体的基因文库。基因文库根据基因类型，基因文库可分为基因组文库和cDNA文库。•基因组文库是指将某生物的全部基因组DNA切割成一定长度的DNA片段克隆到某种载体上形成的文库。基因组文库根据DNA来源又有核基因组文库、叶绿体基因组文库及线粒体基因组文库。cDNA文库cDNA文库是指将某生物某一发育时期所转录的mRNA经反转录形成的cDNA片段与某种载体连接而形成的克隆的集合。•cDNA文库是有时效性的，文库构建时的信息是某一时空条件下的细胞总mRNA，它是在转录水平上反映该植物在某一特定发育时期、某一特定组织或器官在某种环境条件下的基因表达情况，换一种环境或发育时期其表达状况可能就发生改变。再者，cDNA文库只反映加工成熟后mRNA的碱基序列结构。cDNA中不含有核基因中的间隔序列（内含子）及调控区。文库构建的基本过程•目的基因的制备•载体的选择和制备•DNA分子的体外连接•将外源DNA导入宿主细胞目的基因(targetDNA)的制备•目的基因（外源基因）•制备基因组DNA-基因文库(genomiclibrary)—存在于转化细菌中、克隆载体携带的所有基因组DNA的集合•制备cDNA-cDNA文库(cDNAlibrary)•制备用于表达的基因片段：PCR技术、化学合成•DNA的体外连接（DNA连接酶）–粘性末端连接连接效率高•相同酶切末端•TAcloning–平端连接连接效率低–人工接头(linker)法–同聚物接尾法同聚物接尾法目的基因载体DNA+dGTP+dCTPPolyGPolyC3′3′3′3′将外源DNA导入宿主细胞•大肠杆菌受体菌DH5a•转化(transformation)–制备感受态细胞冷的氯化钙处理，细胞处于最适摄取和容忍外来DNA的生理状态.•感染(infection)–转导(transduction)：由噬菌体和细胞病毒介导的遗传信息转移过程五、目的基因的筛选和鉴定(screening/selection)•遗传学方法–插入灭活法(insertioninactivation):抗药性标志选择–标志补救表达产物与营养缺陷互补•α-互补蓝白斑筛选•免疫学方法•分子杂交探针–原位杂交•PCR•限制性酶切图谱互补(-complementation):许多常用载体（pUC系列）都带有一个大肠杆菌DNA的短片段，其中含有-半乳糖苷酶（LacZ）的调控序列和头146个氨基酸的编码序列，该编码区中插入了一个多克隆位点，它并不破坏阅读框，不影响功能。这种载体适用于可编码-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞。虽然宿主和质粒编码的片段都没有活性，但它们可以融为一体，形成具有酶学活性的蛋白质。这样，LacZ基因缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的-半乳糖苷酶阴性的突变体之间实现互补，这种现象叫互补。x-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚--D-半乳糖苷)生色剂IPTG（异丙基硫代--半乳糖苷）：诱导剂•由互补而产生的LacZ＋细菌易于识别，因为它们在生色底物x-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚--D-半乳糖苷)存在下，形成蓝色菌落，而外源片段插入到质粒的多克隆位点以后几乎不可避免地导致产生无互补能力的氨基端片段，因此，带重组质粒的细菌形成白色菌落。•IPTG（异丙基硫代--半乳糖苷）：是-半乳糖苷酶活性的诱导物，也可作为具有Lac或Tac启动子的表达载体的表达诱导物来使用。IPTG;X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)蓝白斑筛选标记蓝白斑筛选常用于PCR产物克隆5’-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNAANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTaqpolymerasehasapropertyofterminaltransferaseactivitythatresultsina3’Aextensionat720C!AAAAAAAAAAAAAAAForwardprimerPCRProductwithTaqReverseprimerT/ACloningAAT4ligaseTransferredtoE.coli+蓝白斑筛选蓝色菌落：载体自连白色菌落：含外源片段基因的鉴定•长度鉴定：酶切、PCR•测序•表达：原核表达，真核表达bp—1534—994—695—515—377—237ABCMPCR鉴定邹昌勇等2006酶切鉴定测序基因鉴定：表达原核表达蛋白催化验证基因的离体活性或体内功能