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基因工程考核方式•平时课堂提问、作业、考勤占30%•期中考试占10%•期末考试占60%，闭卷考试。•问题：•生物之所以体现出各种形态是基因表达的结果，各种生物间的性状千差万别是为什么呢？•例：–青霉菌能产生对人类有用的抗生素——青霉素–豆科植物的根瘤菌能利用空气中的氮气–人的胰岛B细胞能分泌胰岛素调节血糖的浓度•结论：这些都是基因特异性表达的结果•问题：人类能不能改造基因呢？能不能使本身没有的某个性状的生物具有某个特定性状呢历史回顾乳汁中含有人生长激素的转基因牛(阿根廷)ＧＦＰ转基因动物绿色萤光蛋白(greenfluorescentprotein),简称GFP,这种蛋白质最早是由下村修等人在1962年在一种学名Aequoreavictoria的水母中发现。其基因所产生的蛋白质,在蓝色波长范围的光线激发下,会发出绿色萤光。基因工程产品1996年7月5日由罗斯林研究所的伊恩·威尔穆特教授等人通过体细胞克隆法培育问世，是世界上首只成年体细胞克隆动物。世界上第一只成年体细胞克隆羊“多利”基因工程学课程内容•DNA重组的载体•DNA体外重组•重组DNA的转化与扩增•转化子的筛选与重组子的鉴定•目的基因的克隆•大肠杆菌基因工程•酵母基因工程•高等动物基因工程•高等植物基因工程•第二代基因工程•第三代基因工程DNA重组克隆的单元操作基因工程的基本概念1基因工程的基本定义2基因工程的基本过程3基因工程的基本原理4基因工程在生物工程中的地位常见混用名称•基因工程(geneengineering)常和以下名称混用:•遗传工程(geneticengineering);•基因克隆(genecloning);•分子克隆(molecularcloning);•基因操作(genemanipulation);•重组DNA技术(recombinationDNAtechnique)•克隆(clone):作名词时指含有某目的DNA片段的重组DNA分子或含有该重组分子的无性繁殖系.•作动词时是指基因的分离与重组过程。基因工程的基本过程•1工程菌（细胞）的设计构建•2基因产物的生产切接转增检㈠基因操作的过程（切）1.基因的剪刀──限制性内切酶（限制酶）一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特定的切割点上将DNA分子切断。目前已发现的限制酶有200多种。从供体细胞中分离出基因组DNA，用限制性核酸内切酶分别将外源DNA和载体分子切开。重播DNA被限制酶切断后有两个反向互补的“黏性末端”。被同一种限制切断的几个DNA具有相同的黏性末端，能够通过互补进行配对。２、基因操作的过程（连）──DNA连接酶连接酶的作用是：将互补配对的两个黏性末端连接起来，使之成为一个完整的DNA分子。重播用DNA连接酶将含有外源基因的DNA片段接到载体分子上，构成DNA重组分子。3、基因操作的过程（转）——运载体借助于细胞转化手段，将DNA重组分子导入受体细胞中。4、基因操作的过程（增）——转化细胞短时间培养转化细胞，以扩增DNA重组分子或使其整合到受体细胞的基因组中。–细菌培养–昆虫细胞培养–植物组织培养–高等动物细胞培养扩增重组分子或整合重组分子到受体细胞的基因组5、基因操作的过程（检）——筛选鉴定转化细胞•筛选和鉴定转化处理的细胞，获得外源基因高效稳定表达的基因工程菌或细胞。–PCR鉴定目的基因–抗生素筛选标记–报告基因显色筛选•1965年，阿尔伯首次从理论上提出了生物体内存在具有切割基因功能的限制性内切酶。并于1968年成功分离出I型限制性内切酶，但这种酶的切割基因功能不理想。•1970年，美国分子生物学家、遗传学家H·O·史密斯（1931～）分离出了II型限制性内切酶。•1971年，美国微生物遗传学家D·内森斯（1928～）使用II型限制性内切酶，首次完成了对基因的切割。切接•现代基因工程的创始人P·伯格（1926－）在1960年以敏锐的科学预见力提出一个大胆的设想：是否可以创造出一种人工方法，把外界的遗传基因引入动物体内，实现DNA重组，以达到改变遗传性状和治疗某些疾病的需要呢？基因工程的研究意义•1第四次工业革命•2第二次农业革命•3第四次医学革命中国已经批准进入大田的转基因植物转黄瓜抗青枯病基因的甜椒转鱼抗寒基因的番茄生长快、肉质好的转基因鱼(中国)乳汁中含有人生长激素的转基因牛(阿根廷)胰岛素从猪、牛等动物的胰腺中提取，100Kg胰腺只能提取4-5g的胰岛素，其产量之低和价格之高可想而知。将合成的胰岛素基因导入大肠杆菌，每2000L培养液就能产生100g胰岛素！使其价格降低了30%-50%!从人血中提取干扰素，300L血才提取1mg！通过基因工程的方式创造了能合成人干扰素的大肠杆菌，每1Kg的培养液可提取20—4mg干扰素人造血液及其生产4基因工程与环境保护⑴环境监测：基因工程做成的DNA探针能够十分灵敏地检测环境中的病毒、细菌等污染。1t水中只有10个病毒也能被DNA探针检测出来⑵环境污染治理：基因工程做成的“超级细菌”能吞食和分解多种污染环境的物质。通常一种细菌只能分解石油中的一种烃类，用基因工程培育成功的“超级细菌”却能分解石油中的多种烃类化合物。有的还能吞食转化汞、镉等重金属，分解DDT等毒害物质。•但是，就在我们为扮演了上帝造物主的角色而沾沾自喜之时，一片阴云也袭上人们的心头：我们在干预具体某一生命过程的同时，是否也破坏了生命世界应有的和谐与秩序？•附1：推荐用参考书与杂志•《基因工程原理》第二版上下册–吴乃虎科学出版社•《分子生物学与基因工程习题集》–王金发等科学出版社•PrincipleofGeneManipulation（影印版）–Sixthedition高等教育出版社•基因工程概论•张惠展，华东理工大学出版社•«生物化学与分子生物学进展》•中国生物化学与分子生物学学报等等•••附2：小综述推荐内容和写作要求•1.每人从中任意选择一个大题目（也可以自己另选一个题目），或在大题目下自己立一个分题目，但不能与其他人重复。•2.每个题目都要写出原理、产生、发展历史、现状、发展趋势、理论或实践意义。•3.提倡手写。最好是幻灯片形式（也可以是文本格式）。•附3：推荐综述大题目•1.单色和多色荧光原位杂交（FISH）•2.RNA干扰（RNAi）及其应用•3.生物芯片（chip）•4.基因扩增（PCR）•5.基因库（genebank）及序列的查询和分析•6.DNA测序•7.酶联免疫吸附测定（ELISA）•8.遗传病的基因治疗•9.噬菌体展示（phagedisplay）•10.酵母双杂交及其衍生系统•11.基因疫苗•12.基因打靶（genetargeting)•13.随机多肽文库（RPLs）•14.转基因植物•14.转基因植物•15.转基因动物•16.定点突变•17.细菌表面呈现（Bacterialsurfacedisplay）•18.动物克隆•19.胚胎干细胞（ESC）•20.差异显示•21.内含肽（intein）及其应用•22.限制性内切梅•23.基因工程载体•24.生物软件及其使用•25.基因工程相关的网站•26.人类基因组计划（HGP）•27.基因工程产物的纯化策略（载体）•28.基因工程对中国经济的影响•29.发达国家中的基因工程发展及现状•30.基因工程的社会安全及伦理问题•31.制作基因工程网站•32.目前流行的传染性疾病的基因工程治疗思考•33.核糖体展示技术（ribosomedisplay）国内知名专家和单位•中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所•复旦大学生命科学院遗传所•上海生物工程研究所•中国科学院遗传发育研究所•扬州大学农学院•西北农林大学畜牧兽医学院•南京工业大学贺林院士曹雪涛院士杨胜利院士欧阳平凯院士•基因工程学习之分子生物学基础知识基因表达调控1基因表达的概念及调控特点2启动子调控模型3操纵子调控模型4感受应答调控模型5RNA结构调控模型6RNA剪切编辑调控模型RegulationofGeneExpression基因工程三大要素之一受体细胞基因工程三大要素之一供体片段基因工程三大要素之一载体片段供体进入受体的几种方式1、Conjugation中文翻译为“结合”2、Transformation中文翻译为“转化”3、Transfection中文翻译为“转染”4、Transduction中文翻译为“转导”5、Infection感染1基因表达的概念及调控特点A基因表达的概念基因表达(geneexpression)是指基因经过转录、翻译，产生具有特异生物学功能的蛋白质分子的过程。基因表达可分为组成性表达和受调控表达两种形式。影响蛋白质浓度的七个环节基因表达的调控元件复制阶段转录阶段翻译阶段基因表达的调控元件1基因表达的概念及调控特点B基因表达调控的特点基因的表达调控具有时空两重性基因表达调控的生物学意义基因表达调控的模式复杂性按功能需要，某一特定基因表达的先后次序及相对强弱严格受时间的控制，称为基因表达的时间特异性(temporalspecificity)基因表达调控具有时空两重性某种基因产物在个体生长过程中按不同组织、细胞乃至细胞器的空间顺序出现，称为基因表达的空间特异性(spatialspecificity)基因表达调控的模式复杂性基因表达调控环节众多，其中转录调控是关键.真核生物与原核生物相比的基因表达调控范围要大基因表达调控元件可分为核酸和蛋白质两大类基因表达调控实质是两者之间的相互作用，包括核酸分子内或分子间的相互作用、核酸和蛋白质之间的相互作用、蛋白分子内或分子间的相互作用DNA的复制可被分为三个阶段，即复制起始、延伸和终止。每个DNA复制的独立单元被称为复制子（replicon），主要包括复制起始位点（Origineofreplication）和终止位点（terminus）。原核生物的整个染色体上一般只有一个复制起始位点。DNA复制起始位点和复制子的结构•大肠杆菌DNA的复制需要有20种左右的酶和蛋白质因子参与，整个DNA复制机器被称之为DNAreplicasesystem或replisome。•Helicase，•任何DNA在被复制前都必须解开双链，这个过程是由helicase可在ATP的作用下将DNA母链不断解开形成单链。•Topoisomerase，主要功能是消除DNA解链过程中所产生的扭曲力。•DNA结合蛋白，使新解链的DNA保持稳定结构。•Primases，为DNA复制提供RNA引物。•DNApolymerases，合成新生DNA链，切除RNA引物。•DNALigases，使新生DNA链上的缺口（3'-OH,5'-p）生成磷酸二酯键。DNA复制起始位点和复制子的结构•大肠杆菌中的复制起始位点是OriC，全长245bp，•该序列在所有细菌复制起始位点中都是保守的。DNA复制起始位点和复制子的结构启动子促进DNA转录的DNA顺序，这个DNA区域常在基因或操纵子编码顺序的上游，是DNA分子上可以与RNApol特异性结合并使之开始转录的部位，但启动子本身不被转录。RNA转录起始-35区-10区TTGACATTAACTTTTACATATGATTTTACATATGTTTTGATATATAATCTGACGTACTGTN17N16N17N16N16N7N7N6N7N6AAAAAtrptRNATyrlacrecAAraBADTTGACATATAAT共有序列原核生物的启动子DNA-蛋白质相互作用范例1.HTH型(Helix-turn-helix)2.Zinc-finger蛋白3.Homeodomain4.Leucine-zipper5.Helix-loop-helix基因表达调控的生物学意义适应环境、维持生长和增殖维持个体发育与分化调控程序上的缺陷或紊乱将导致严重后果基因表达失控会导致严重后果2启动子调控模型A启动子的组成及功能B启动子的顺式增强作用C启动子的反式协同作用D启动子结构的多样性选择2启动子调控模型A启动子的组成及功能启动子