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3D多细胞肿瘤球的培养原创2017-04-20医生科研助手3D多细胞肿瘤球是在体外应用组织培养方法使肿瘤细胞以多细胞集聚体的形式生长成为具有三维结构的球体。与传统的2D贴壁细胞培养模型相比，3D多细胞肿瘤球可以通过模拟三维细胞网络、细胞与基质、细胞与细胞之间的相互作用，从而更加贴近肿瘤组织中相应的病理生理特征。因此，3D多细胞肿瘤球培养模型已经逐渐应用于干细胞培养和分化、癌症研究、药物和毒性筛选及组织工程等特定应用中。虽然3D多细胞肿瘤球模型具有更显著的实体肿瘤生理相关性，但是与2D贴壁细胞培养模型相比，获得大量相对统一的3D多细胞肿瘤球模型需要一系列的培养过程和表征手段。本文利用LiquidOverlay的制备方法，以乳腺癌细胞MDA-MB-231和MCF-7为模型制备3D多细胞肿瘤球并采用倒置显微镜、激光共聚焦显微镜和环境扫描电镜对其进行详细表征。1实验前准备工作1.提前24h取12mLDMEM和RPMI1640完全培养基（含10%FBS，下同）于50mL离心管内，置于4℃冰箱中预冷；2.将分装好的Matrigel基质胶提前24h从-20℃放入4℃，使其融化成液体状态；3.将无菌的1mL移液器枪头放入无菌50mL离心管内，置-20℃冰箱预冷。2琼脂糖包被96孔板1.准确量取6mLRPMI1640培养基（或DMEM培养基）于2个10mL的注射玻璃瓶内，加入90mg琼脂糖，盖塞后放入80℃的水浴锅内加热溶解30min；2.加热结束后，将注射瓶放入灭菌锅内，115℃灭菌30min；3.灭菌完成后，迅速取出注射瓶放入超净台内。将注射瓶内的琼脂糖溶液倒入无菌的加样槽中，用多通道移液器以每孔60μL的量加入96孔板内。注意：由于琼脂糖溶液在室温时会凝固，因此从灭菌锅内取出琼脂糖溶液后一定要快速转移至超净台内并迅速加入至96孔板中。此外，为保证加样时琼脂糖不冷却，需要同时灭菌加样槽和100μL的移液器枪头。4.加入完成后，96孔板要保持水平约30min使孔内的琼脂糖凝固。3配置含Matrigel基质胶细胞悬液1.取对数生长期的MDA-MB-231细胞（或MCF-7细胞），胰蛋白酶消化后进行细胞计数，用RPMI1640完全培养基（或DMEM完全培养基）将细胞悬液浓度调整至2.0×105cells/mL，备用。2.将盛满碎冰的烧杯喷完酒精后放入超净台内，将RPMI1640完全培养基以及解冻的Matrigel基质胶从冰箱内取出置于冰上。注意：由于Matrigel基质胶在室温下溶液凝固，因此在操作过程中一定要保持低温。3.将预冷的移液器枪头取出放置于超净台内。根据计算量（2.5%，v/v）用移液器将300μLMatrigel基质胶加入到12mLRPMI1640完全培养基内，迅速混匀。注意：由于Matrigel基质胶在室温下溶液凝固，因此使用的移液器枪头也需要预冷。4.加入步骤1中的细胞悬液（约600μL），使细胞浓度为10000cells/mL，迅速混匀，备用；4将细胞悬液铺入琼脂糖包被的96孔板1.将上述步骤4中配置好的含有Matrigel基质胶的细胞悬液放入加样槽内，用多通道移液器吸取200μL加入到包被琼脂糖的96孔板内。2.采用低温离心机进行离心，离心条件为4℃，1000×g，10min。注意：离心96孔板时为保持无菌，将96孔板的周围用封口膜封住。3.离心完成后，取出96孔板，摘下封口膜，喷洒酒精后放入培养箱内培养。整个培养流程如图1所示。4.在培养的第3、5和7天，更换孔内的100μL培养基并采用倒置显微镜观察肿瘤球的形态。5.若要采用3D多细胞肿瘤球进行药物试验，在培养7天后，用移液器取出孔内的100μL培养基，加入100μL给药溶液，然后置于培养箱内培养并定期采用倒置显微镜观察肿瘤球的生长状况（图2）。53D多细胞肿瘤球的表征1.倒置显微镜观察3D多细胞肿瘤球形态：直接将96孔板置于倒置显微镜下观察即可。2.激光共聚焦显微镜观察：用移液器小心取出孔内的肿瘤球，用PBS清洗3遍后，采用4%多聚甲醛固定，并用Hoechst33258对细胞核进行染色，PBS清洗3遍后在激光共聚焦显微镜下观察（图3）。3.环境扫描电镜观察：用移液器小心取出孔内的肿瘤球，用PBS清洗3遍后，固定干燥后进行环境扫描电镜观察（图4）。图4