果树生理学：一、授粉受精-1

杨洪强第一专题果树生殖生理与分子生物学果树传粉受精果树花芽分化杨洪强果树传粉受精•授粉和受精大多数果树需要经过授粉受精才能结实（授粉刺激果实形成；受精形成种子，种子刺激果实发育），授粉受精是生殖生长开始的标志，是提高坐果率的核心与最关键因素(配植授粉树、选择自花结实品种、人工授粉、花期放蜂与喷硼、延长有效授粉期)。杨洪强•自花授粉、自花（不）亲合、自花结实•异花授粉、异花（不）亲合、异花结实•注：结实和产生种子并不等同；种子是维持果实发育的重要因素，产生两性种子，必须自花或异花亲合；不亲合或不受精也能形成果实。杨洪强单性结实----不受精而形成果实，一般无种子，如香蕉、菠萝、柑橘、柿子、无花果等；无种子不一定是单性结实，如无核葡萄，需要授粉刺激才能结实但种子败育。无融合生殖----不受精也能产生有发芽力的胚（种子），如湖北海棠，柑橘（由珠心或珠被细胞产生珠心胚）。杨洪强单性结实可生产无籽果，但一般产量低、果实小、不能进行杂交育种杨洪强授粉：指花粉由雄蕊的花药传到柱头的过程受精：雌雄配子的结合从授粉到受精需要经过亲合性识别-----花粉萌发----花粉管生长-----雌雄配子在失去活性前（有效授粉期内）结合杨洪强果树传粉受精一、花粉与雌蕊的相互识别二、花粉萌发三、花粉管生长四、花粉管与花柱的相互作用五、雌雄配子融合六、有效授粉期七、授粉受精后的生理生化变化杨洪强一、花粉与雌蕊（柱头）的相互识别落在柱头上的各种花粉能否最终完成受精，取决于花粉和柱头之间的亲和性细胞相互识别是亲和性的前提1、识别(recognition)一类细胞与另一类细胞在结合过程中所进行的特殊反应。它要求从对方获得信息，此信息可以通过物理的和化学的信号来表达。杨洪强花粉与柱头之间的相互识别，涉及到花粉壁中的蛋白质与柱头乳突细胞表面的蛋白质薄膜之间的相互作用花粉内壁蛋白由花粉本身制造，具有很高的酶活性，主要是与花粉萌发和花粉管穿入柱头有关的酶类；外壁蛋白参与识别反应杨洪强杨洪强柱头：多数植物的柱头有乳突，常覆盖一层水合蛋白质薄膜，与花粉粒和柱头的识别有关。（1）干柱头（drystigma）：雌蕊成熟时，柱头没有分泌物，多数被子植物属此类。（2）湿柱头（wetstigma）：雌蕊成熟时，柱头能产生很多液态分泌物。杨洪强柱头上的分泌液主要有蛋白质、氨基酸、酚类化合物、脂类和糖类。蛋白质参与识别反应；脂类有助于粘住花粉粒，减少柱头失水；酚类有助于防止病虫对柱头的侵害，有选择地促进花粉粒的萌发；糖类供给花粉管生长的营养。杨洪强如果相互识别，花粉管尖端产生能溶解柱头薄膜下角质层的酶（角质酶），使花粉管穿过柱头而生长，直至受精如果不识别，柱头的乳突细胞立即产生胼胝质(callose)，阻碍花粉管穿入柱头，花粉管尖端也被胼胝质封闭，花粉管无法继续生长，使受精失败杨洪强识别表现为植物的亲合性植物在进化过程中形成了雌蕊在受精前识别花粉的能力（机制），使柱头或花柱可以辨别某类花粉，并对这类花粉萌发或生长产生抑制能力，使受精不能完成，此为授粉不亲和性。来自不同种植物的雌蕊与花粉，两者基因型差异较大，产生的不亲和性称种间不亲和性（intra-specificincompatibility），该机制有利于保持物种的稳定性。来自同种植物的雌蕊和花粉，两者基因型过于一致，产生不亲和性称种内不亲和性（inter-specificincompatibility），该机制有利于种内的遗传变异。杨洪强植物种内不亲和性最典型的是自交不亲和性（self-incompatibility,SI）。遗传学将自交不亲和性定义为能产生具有正常功能且同期成熟的雌雄配子的雌雄同体植物，在自花授粉或相同基因型异花授粉时不能受精的现象。杨洪强自交不亲合是植物防止近亲繁殖的一种天然屏障。（实线：亲和，虚线：不亲和）杨洪强自交不亲和性是显花植物的一个重要遗传性状绝大多数植物的自交不亲和性受具复等位基因的单一位点S-locus控制(S代表不育性，sterility)，即单因子自交不亲和性（mono-factorialSI），不同的S-locus多态型用S-单元型（S-haplotype）来描述。杨洪强根据花粉不亲和表型及其遗传控制方式的不同，单因子SI分为两类：一类是以十字花科植物为代表的孢子体自交不亲和型（Sporophyticself-incompatibility,SSI），花粉自交不亲和表型由产生花粉的植株即孢子体基因型决定；另一类为茄科、蔷薇科、玄参科、罂粟科等植物中出现的配子体自交不亲和型（Gemetophyticself-incompatibility,GSI），该类花粉表型由其本身的单倍体基因型决定。杨洪强2、孢子体不亲合（1）产生于花粉与柱头相互作用的初期(柱头上)（2）花粉不萌发、萌发但不能进入花柱、能进入花柱但很快被胼胝质封闭（3）一般发生于有三核花粉（一个营养核，两个生殖核）和柱头为干性的植物上，如十字花科、菊科植物。（4）主要由雌蕊的基因型决定（花柱的糖蛋白与花粉粒外壁的糖蛋白相互识别）杨洪强3、配子体不亲合（1）发生于花粉萌发和初期生长后（花柱中）（2）一般发生于有两核花粉和柱头为湿性的植物上，如蔷薇科（大部分果树）、豆科、茄科、百合科植物。（3）主要取决于花粉自己的S等位基因的产物和柱头表达的识别蛋白（S-蛋白可使花粉管的游离钙离子激增而导致花粉管生长受抑）单基因座控制的自交不亲和性植物的自交不亲和的遗传学花粉基因型：S1S2，S3S4，S2S3；雌蕊基因型：S1S2花粉粒表型由自身单倍体基因型决定。左：S1S2花柱自花授粉中，所有的花粉管生长被抑制。中：S3S4花粉为S1S2花柱异花授粉，所有花粉管完成受精。右：S2S3花粉为S1S2花柱授粉，S2的花粉管被抑制，S3花粉管正常生长。杨洪强（4）花粉自己的S基因产物尚未分离到，但已从芸薹属植物上克隆到2种S位点柱头专一性基因SLG（编码一胞外糖蛋白）和SRK（编码一位于膜上的S受体激酶）-----授粉亲合性的识别可能是一种蛋白磷酸化级联反应。杨洪强（5）另一S基因产物----S-RNase，是在柱头表达的糖蛋白，具有核酸酶的活性，S—核酸酶S-RNase已在多种植物的基因中克隆S基因，如苹果、梨、杏、樱桃等但确定S基因产物具有S-RNase特性是在自交不亲合的烟草上：用反义S3基因转化的植株（其S3基因不能表达）不能抑制自体的S3花粉的生长。用S3基因转化的S1S2植株（其S3基因超表达）能抑制S3花粉的生长杨洪强S-RNase生理生化特性（1）S-RNase一般含有250个氨基酸（2）可被花粉管吸收，并降解花粉RNA而抑制花粉管生长（3）分布在花柱引导组织的胞间隙（4）在花柱1/3以下部位浓度最高（识别区）（5）花粉管进入胚珠所经过的组织内均有S-Rnase，但当浓度达到一定域值时，自交不亲合性才发生（6）为成熟的花柱S-RNase浓度较低（蕾期授粉易亲合）（7）S-RNase并不参与所有配子体不亲合，且其S基因产物与SLG、SRK或S-RNase没有同源性杨洪强S-RNase的作用机理一般认为自交不亲和是由于花柱中的S-RNase进入花粉管，作为细胞毒素使自己的花粉管RNA降解，细胞溶解，导致花粉管生长抑制。S-RNase等位基因专一性作用，存在单基因和双基因控制SI的两类假说：杨洪强单基因假说认为，S位点上的一个基因同时控制花柱和花粉的自交不亲和性。例如，在烟草花柱中检测出了低水平的S-RNase基因的RNA转录本，在成熟的新鲜花粉粒的内壁中也测出了S-蛋白，这表明单基因控制的可能性，可能存在一个基因同时编码介导自交不亲和反应的花柱和花粉产物。杨洪强双基因假说的理论基础为花柱S-基因产物作为细胞毒素降解自己的花粉管RNA，导致自交不亲和性，假说认为，花粉和雌蕊中分别存在不同的S-基因控制着自交不亲和性，其证据来自转反义S3-RNase基因的膨大矮牵牛植株表型由自交不亲和变为亲和，但其花粉表现出正常的自交不亲和性；一个自交亲和日本梨品种被鉴定为S4-RNase基因缺失，但这种缺失并不影响花粉的功能。这些结果都显示S-RNase与花粉表型控制无关，从而支持了双基因假说。杨洪强双基因假说分为“膜受体学说”（receptormodel）和“胞内抑制剂说”（inhibitormodel）两种模型。“膜受体学说”认为，S-RNase被特异性地摄入花粉管，花粉S等位基因产物是一种与花粉管的质膜或细胞壁结合的受体，仅允许自己的S-RNase进入花粉管。（但体外核酸酶实验证明，花粉管吸收S-RNase没有表现出特异性）杨洪强“胞内抑制剂说”认为，花粉S-基因编码一种特异的胞内RNase抑制剂，其产物抑制除自己的S-等位基因编码的S-RNase外的其它各种S-RNase的活性。用免疫组织化学标记方法，证明亲和的和不亲和的花粉管细胞质中都有S-RNase的积累。杨洪强矮牵牛和烟草的S-RNase嵌合体实验表明S-RNase存在两个分离的功能性结构域，一个是每个S-RNase独有的S-等位基因特异性结构域（SD），一个是所有S-RNase共有的催化结构域（CD）。简单抑制剂模型认为，花粉S-等位基因产物有类似S-RNase的两个分离的结构域：RNase抑制剂结构域（ID）和S-等位基因特异的结构域（SD）。杨洪强当S1花粉为S1S2花柱授粉时，S1-RNase和S2-RNase均被S1花粉管吸收。花粉管蛋白（S1基因产物）的SD（特异性结构域）与自己相同基因型的S1-RNase的SD结合，而S1-RNase的CD（催化结构域）仍保留着，所以S1-RNase仍有活性，使得花粉管RNA降解，导致不亲合。而花粉管蛋白的ID（抑制剂结构域）与非己的S2-RNase的CD结合，S2-RNase活性被抑制，不能花粉管RNA降解，从而表现亲合。S-单元型特异的花粉管生长抑制模型杨洪强4、改善亲合性（1）抑制识别蛋白的表达：转录抑制剂提高新红星苹果自花亲合性（2）化学药剂处理：NAA、CEPA、BA、EDTA-Fe、脯氨酸、谷氨酸等可提高“廿世纪梨”的自花结实率（3）气候因素：“廿世纪梨”自花结实率15°C下最高，23°C下次之，30°C最差；橘苹苹果10°C下最低，20~22°C时最高杨洪强（4）掌握好时期避开识别蛋白大量表达期：蕾期、雌蕊衰老期、截短柱头“长十郎”梨自花结实率通常小于20%，但在蕾期可打30~60%（SDS电泳分析，花期花柱中有新的糖蛋白产生）杨洪强（5）异花重复授粉先异花授粉（死花粉、异种不亲合花粉），间隔1~2天再自花授粉机理：先锋花粉（pioneerpollen）先把识别蛋白结合掉、耗竭掉？（6）用亲合花柱头分泌物处理不亲合花的柱头机理：抗原、抗体关系？杨洪强二、花粉萌发1、萌发特点（1）花粉萌发很快：条件适宜，几分钟就萌发（2）萌发期间蛋白质合成极快：花粉置于培养基中，2分钟就能发现大量多核糖体增加（3）有群体效应：单个花粉不易萌发，钙？（核桃花粉太多不易，坐果率下降）杨洪强杨洪强（4）萌发所需的mRNA和部分蛋白质已存在于花粉粒中：转录抑制剂放线菌素D对萌发没有影响；萌发前后mRNA没有区别；不论是否抑制mRNA合成，蛋白质电泳带型没有区别（5）萌发需要合成部分新蛋白，但无需新基因表达：新合成的蛋白主要用于花粉萌发后的初期生长，新基因的表达用于维持花粉管的生长。杨洪强萌发时，花粉先吸收水分而膨胀，原生质开始流动，花粉的内壁从萌发孔露出，作管状延伸。杨洪强杨洪强2、影响萌发因素（1）环境条件：主要是温度，一般为25-30C，苹果为10-25C；湿度也影响（2）营养：贮藏营养水平（枝与花）；碳水化合物（如蔗糖）；氨基酸；矿质元素（钙、硼、钴、钼）（3）激素：花粉中含有生长素和赤霉素；外源生长素、细胞分裂素和多胺促进花粉萌发；赤霉素可促进部分植物花粉萌发，但抑制葡萄、苹果、栗等多种果树花粉的萌发（诱导单性结实）杨洪强三、花粉管生长1、花粉管生长为脉冲式生长2、生长只局限于顶端区，为极性生长（其他细胞的生长发生于整个细胞表面）3、花粉管可